简介
研究背景
肝细胞生长因子 (Hepatocyte growth factor， HGF) 是一类多功能生长因子，具有刺激血管增生 作用，通过局部肌肉注射携带 HGF 基因的质粒 DNA 可明显促进肢体急性缺血部位新生血管的形成，在 临床上具有治疗缺血性疾病的应用前景该文章对此进行了大量的研究，通过成熟的工艺生产药用级重组质粒 pUDK-HGF 注射液。其工艺是碱裂解后离心处理获得澄清碱裂解液，直接用 Q-Sepharose XL 阴离子交换层析捕获质粒 DNA；再用 Sephacryl S-1000 分离除去 RNA；用 Source 15Q 对质粒 DNA 进行精制。随着新填料 plasmidselect 的出现，生产超螺旋质粒 DNA 的工艺随之更新，因此本文建立新的 pUDK-HGF 纯化工艺，该工艺为碱裂解细菌后，用绸布滤去细胞碎片等絮凝物，获得碱裂解上清液； 上清液经 300 kDa 超滤柱进行浓缩，获得的浓缩液经 Sephacryl S-1000 层析柱除去 RNA，然后通过 plasmidselect 层析柱对超螺旋质粒 DNA 进行捕获， 获得高纯度的超螺旋质粒 DNA，再通过琼脂糖凝胶 6BFF 对超螺旋质粒 DNA 进行脱盐；最终采用异丙醇沉淀质粒 DNA，75％ 乙醇洗涤，配方溶液重溶获得产品。
原理
实验流程
图 1 产品提纯流程图
材料与仪器
步骤
实验方法
变性包涵体通过 0.45µm 滤膜（Millipore，Billerica，USA）以去除聚集体。将滤液加载到 5mL HisTrap FF柱（Ni Sepharose 6 Fast Flow，GE healthcare，Fairfield，USA）上，该柱用含有 50mM 咪唑的缓冲液 A 平衡。HisTrapFF 的结合容量为每毫升包装 200 毫克。用平衡缓冲液洗涤未结合的蛋白质。用缓冲液 a 中的 500mM 咪唑以 15CV/h 的流速洗脱结合的蛋白质，然后根据在线紫外检测器（ZHD，志明生物，中国南京）测定的洗脱液吸光度收集结合的蛋白质。用 30% 饱和（NH4）2SO4 沉淀含有靶蛋白的级分以除去咪唑。在 3500g 离心 30 分钟后，收集蛋白质沉淀并在缓冲液 A 中再溶解。然后将再溶解的蛋白质溶液加载到含有阳离子交换剂（5mL Hitrap CM FF，GE healthcare，Fairfield，USA）的色谱柱上，其结合容量为 250mg/mL 填料。加载和洗涤后，用含有 0.1-1M NaCl 线性梯度的缓冲液 A 以 20CV/h 的流速洗脱结合的蛋白质。
为了进一步提高目标蛋白的纯度，使用具有 Ni Sepharose High Performance（GE healthcare，Fairfield，USA）的 5mL HisTrap 柱纯化重组蛋白疫苗。HisTrap HP 的结合容量为每毫升包装 200 毫克。与 HisTrap FF 柱上的过程类似，用含有 100-500mM 咪唑的缓冲液 A 以 15CV/h 的流速洗脱与 Draft 结合的蛋白质。在变性条件下逐步纯化重组蛋白。
内容来源：Cytiva
来源：丁香实验
