表观遗传学_核小体组蛋白 H4 赖氨酸 20 经 SET8 甲基转移酶甲基化的机制研究

研究背景

着丝粒是与有丝分裂纺锤体微管连接的特殊染色体区域，招募特定区域的核小体，其中着丝粒组蛋白变体即指用酵母中的 Cse4 取代了规范组蛋白 H3 后的产物。可以使用含 Cse4 的核小体进行原子结构测定，这是着丝点－核小体复合物的机理和结构研究的起点。

在核小体的早期研究中，人们使用内源性来源的染色质，如鸡红细胞或大鼠肝脏进行提取。但近年来出现了新的标准方案，可以使用单个非洲爪蟾组蛋白表达作为包涵体，进行变复性的纯化后完成组蛋白八聚体的重折叠来得到组蛋白。这种方法也使得核小体和着丝粒－核小体复合物得到了各种高分辨率X射线晶体结构，从而进行一系列的机制研究。

实验流程

图 1 大肠杆菌组蛋白提纯流程图

实验方法

组蛋白八聚体的纯化：将 H2A，H2B，H4 和 H3 的变体 Cse4（来源于酿酒酵母）共同设计在质粒上进行共表达，质粒通过测序验证后在 Rosetta 2 E. coli cells 中表达，生长在 37°C 下以 220rpm 振荡培养。通过离心收获细胞，重悬于含有蛋白酶抑制剂的 HSB 高盐缓冲液（2M NaCl，50mM HEPES pH 7.5，10% 甘油，1mM TCEP）中，并直接在 -80°C 下冷冻储存。

将细胞重悬于高盐缓冲液中并通过超声裂解，裂解物以 40000xg，20°C 条件下离心 1h。将上清液与 4 mL TALON 金属亲和填料一起孵育，并在 4°C下搅拌孵育1小时。转移到重力柱中洗涤后，用含有 50 mM EDTA 和 400 mM 咪唑的 HSB 高盐缓冲液洗脱蛋白质。将洗脱液进行超滤浓缩（10000 MWCO）后于 3000xg，4°C 下离心 15 分钟，直到体积小于 2mL。浓缩后的洗脱液使用层析的方法纯化：在 120mL Superdex 200 分子筛层析柱上纯化去除杂质，得到组蛋白八聚体，并使用 SDS-PAGE 考染检查产物的纯化情况。

DNA 片段的纯化：通过 PCR 产生 147bp 的 Widom601 DNA 序列，在 HiTrap Q 离子交换柱上进行 DNA 片段纯化。

核小体的制备：DNA 和组蛋白八聚体以 1.1：1.0 摩尔比混合。采用盐梯度透析法制备核小体，60°C 下梯度处理 4h 以上。随后使用 24 mL Superdex200 或 2.4 mL Superose6 分子筛层析柱进一步纯化核小体，去除多余的 DNA。分子筛层析缓冲液为 30 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl 和 1 mM TCEP。

通过以上方法制备了酵母着丝粒核小体后，进行了冷冻电镜下的结构解析与相关作用机制的研究。