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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
WB结果中可能出现有目标蛋白条带,但是目标条带在膜上颜色较浅,请问这是什么原因呀?
天一湖医者
转膜不充分 规范转膜的操作;优化电转条件;可将两张膜叠加在一起,防止转膜过度,或使用小孔径膜洗膜过度 洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,减少洗膜次数,洗膜时间和温度封闭过度 减少封闭时间,试用不同的封闭液曝光时间过短 延长曝光时间,如使用化学发光成像系统,可调整显示灰度值抗体染色不充分 延长孵育时间或增加抗体浓度抗体问题 抗体浓度低 增加抗体浓度抗体和抗原亲和力不足 增加抗体浓度抗体活
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问
Western Blot还需要剪膜么?
一只软妹
可以剪,不剪的话容易有其他非特异性结合,容易脏
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问
大家好,我是新手,最近做的WB结果,请大家点评谢谢谢谢!
bamboopiggy
你gapdh太强了,和你的目的条带分开显影,不要一起显,应该都会出来的。
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问
请教各位,内参不齐,怎么判断是转膜夹的问题还是上样量的问题呢
宁儿小贤
如果测过bca,调整过样品浓度的话就一般不是上样量的问题,看你的图不太像转膜夹的问题。
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问
请问显影膜上有黑点是什么原因?
宁儿小贤
膜上的黑点就是脏东西,膜很容易吸附其他物质,每次洗的时候时间长一点,多洗几次,镊子夹在同一个地方,尽量不要碰别的地方
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问
FLG跑WB一直跑不出来……
天一湖医者
可能原因:1、孵一抗的方法;2、抗体;3、曝光时间;4、转膜;5、手法不稳定;6、其他你根本没察觉到但对结果影响大的小毛病。
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问
WB条带的背景
秋秋欣欣
可能是你没封闭后,一抗可以用奶粉直接稀释抗体,洗膜的时候可以多洗几次,水换勤一些
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问
内参不齐这是什么原因?样品浓度是5
bamboopiggy
1 可能这个管家基因不适合在你的实验中做内参,换个内参,2,bca法测蛋白浓度还是有差异的,你可以根据这个内参,然后读个灰度值,再重新调一下内参
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问
成骨细胞NLRP3炎症小体如何诱导形成?
秋秋欣欣
NLRP3具有三个特征性结构,分别是C末端LRR,位于中心的NACHT,和N末端的PYD结构域。在外源性病原体成分或内源性配体的作用下,NLRP3的结构打开,由其PYD结构域招募转接蛋白ASC,再由ASC的CARD结构域继续招募胱天蛋白酶-1(caspase-1)前体,形成NLRP3炎症小体,并对caspase-1前体进行剪切,生成有生物活性的caspase-1进一步促进IL-1β前体(pro-I
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问
raw诱导破骨细胞
秋秋欣欣
感觉你的细胞不太像,形成的是很多空泡,不是细胞
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问
求助,WB没有条带怎么解决
bamboopiggy
如果没条带,最好是重新配抗体,别用回收的,有的抗体回收最多用3次就不行了。
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问
求助,WB背景黑,条带淡怎么解决
Eason老歌迷
现在都夏天了,你减少二抗孵育时间看看。我之前也遇到过这种情况。
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问
求做western和IP裂解蛋白的注意事项(小分子蛋白10kd左右),因为一直IP不下来,input有时候也无条带……
Eason老歌迷
裂解蛋白,一定要在冰上进行,因为有的蛋白很容易降解,尤其是现在天气热,你搁常温一会就降解了
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问
WB预制胶和普通胶的差别是什么呢?除了配制的差异
bamboopiggy
其实预制胶如果不是梯度胶,和你自己配的没有什么区别,只是省了你的事,多花点钱而已。
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问
寻找多个序列的直系同源序列,如何精准查确?
Eason老歌迷
同源序列的查找,顾名思义就是我们要找的是和这个序列相似的序列,比如拟南芥,我们找到这个植物的一个序列,那就是把一个数据库当作比对的参照物,把这个一个拟南芥的序列与这个数据库进行比较,查看那些物种的序列和这个序列相似,这个是线上的方法,我们直接利用ncbi中的官网的方法比较blast。
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问
系统进化树问题,如何确定相关序列?
dxy_gwrp7ndq
NCBI 、DNAMAN 、DNAStar 、Bio edit 均可构建进化树
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问
rip对照实验的设计
天雨心晴
敲低,原始,和空载三个都要做。
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问
蛋白分子量62-21kd,忽然发现一直用的PVDF膜是0.22μm的,对结果有影响吗?
秋秋欣欣
出现哑铃状的结果图最可能是你胶的问题,0.22的膜转62的蛋白完全没有问题
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问
酶的溶解需要在冰上进行吗?
bamboopiggy
需要在冰上,或者您在4度的coolroom里溶解也可以。反正不能温度高了
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问
求助 | 为什么总有杂带呢,连内参都有
bamboopiggy
可以用,趋势在就可以用,这个杂带是抗体问题。
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