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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
细菌做定量pcr,以cDNA做模板,pcr条带很杂,而用基因组做模板条带单一,这是什么原因?谢谢回答!
bamboopiggy
cdna是不同长度的,如果你的引物不是那么特异,产物就会很多。而genomic dna做模板,引物是跨内含子设计,比较长,非特异产物在30秒内扩增不出来
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问
请问半荧光定量引物怎么设计?片段大小设计多少合适?
天一湖医者
荧光定量一般限定在100-250bp间,半定量似乎没有太严格的限制,可以放宽到500-600bp吧
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问
请问在进行荧光定量时,一般qpcr片段应设计多大,一般情况下是80-180bp左右大小,但看其他文献有的设计片段大小240bp?
天一湖医者
荧光PCR主要包括两种形式一种是sybr green I技术,对片段长度没有特殊要求,一般100-400都可以,当然扩增片段越大,溶解曲线温度越高,有利于区别引物二聚体形成的溶解曲线,SYBR GREEN的特异性主要看引物;
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问
做某个细菌绝对定量需要找到这个细菌引物,然后通过模板DNA扩增成目的片段,然后再将目的片段导入到质粒中,再稀释成标准品。是这样吗
秋秋欣欣
是这样的,做细菌的定量,需要先找到目的片段的引物然后扩增
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问
链霉菌能否直接以基因组作为模板进行荧光定量PCR?
bamboopiggy
这个取决于你的实验目的,看你是要检测什么。是mRNA还是genomic DNA
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问
链霉菌做荧光定量 PCR能不能以基因组做模板?
汤姆卜丽波
可以做模板,这个问题应该是引物特异性不高才会出现
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问
实时定量PCR的一个小问题?
未来9
SYBR GreenⅠ较另EvaGreen的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。在定量PCR中饱和染料EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。
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问
PCR引物如何看是否容易形成引物二聚体?
月下扣动板机
1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了,形成引物二聚体的原因很多,如引物设计的不好,在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对;退火温度没有达到最佳,实在不行就做个温度梯度吧;再就是试着改变一下循环数,也许会有帮助。
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问
想问一下pcr扩增后,5ul跑胶出现单一条带,剩下的不进行切胶回收,直接送去测序可以吗?
bamboopiggy
可以,我都是这么干的,测序公司会切胶回收的
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问
核酸扩增出现不规则曲线是什么原因?
师医生说
从人,机,料,法,环找下原因:操作流程是否正确,加样孔有无异常,加样中有无气泡干扰,电压是否稳定。该批次重新实验。
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问
核酸空白体系出现翘尾该怎么处理?
bamboopiggy
看是不是这个孔有问题,或者是你污染了?
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问
求助PCR条带问题?
dxy_2cic6tye
用的多大浓度的胶?目的片段大的话,胶浓度应该低。另对照样本跑的怎么样?marker图谱是否正常
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问
多重PCR可以分开做吗?十六对引物就做十六孔,都是同一次逆转的cDNA,然后一起扩增
balalaLy
如果是要样品或者组别之间进行比较最好一起做或者至少每次做都有可以相互比较的组别。
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问
qPCR部分扩增条带不显示cp值?
汤姆卜丽波
可能是加样问题或者八联管出了问题
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问
荧光定量PCR的mix是否可用于数字PCR反应体系?
帝尊
不可以的,酶的参与种类不同,未必适用。
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问
新冠病毒核酸检测质控品怎么稀释浓度
亦书甜恬
目前国内新冠质控品都是非定值质控品,按非医疗器械管理。所给的不同水平量值有单位水平也有数值,只能当做参考。根据你的试剂检测下限200copies/ml,那要得到的靶浓度应该是300-600,考虑到操作方便性,日常工作使用时直接按2.5倍稀释为宜,得到靶浓度为556copies/ml。检测时核酸提取加样量通常为200ml,实际稀释操作80ml质控品原液+120ml稀释液即可。以上供参考。
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问
PCR问题,求助一下?
bamboopiggy
先确定你的primer正确,然后试着降低annealing temperature试试
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问
qPCR实验内参基因CT值问题?
慈悲为怀医德为镜
内参一般15-20之间比较可信。
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问
多重PCR条带问题?
bamboopiggy
非特异性产物?条带大,是不是因为模板量大啊?
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问
公司定的pcr引物如何验证是否合适?
丁香清香
可以用于正式实验的引物必须满足以下条件:a溶解曲线单峰,窄而尖,否则可能有非特异性扩增;峰的位置横坐标一般在80度以上,这个温度为PCR产物的解链温度,如果在75度附近,可能是引物二聚体,miRNA染料法检测时,溶解曲线的峰的位置可能在75度附件b琼脂糖电泳为明亮的一条带,条带一般在100bp以上,如果设计引物时PCR产物在100bp一下,需要仔细辨认是否为引物二聚体;引物二聚体的条带一般在50b
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