植物学技术

植物组织培养常见问题解析Coolaber1. 培养基的配制注意事项植物组织培养最常用到MS培养基，包含十几种化合物。因为有些化合物相遇会发生化学反应产生沉淀，影响培养基的营养成分，准备MS培养基需要配制多种高倍母液。且配制母液时，尤其涉及大量元素的母液时，一定要等一种成分溶解之后，再缓慢的添加另一种成分，切记“一锅煮”，即不能将各种化合物一齐添加进去。可选用Coolaber的MS培养基基盐（PM1011）在自行加入蔗 ...

中国农科院棉花研究所针对 20 多个棉花品种，成功建立了高效、稳定的规模化转化体系，以流水线的操作方式，建立了高效、工厂化的棉花转基因技术体系。本文援引中国农业科学院棉花研究所的发明专利内容，以制备转 GAPDH 基因棉花的具体方法为例，以应用实例演示棉花转基因技术的具体应用案例。土壤盐渍化是一个全球性生态问题，是当今世界土地荒漠化和耕地返化的主要因素之一，土地的盐渍化对农业生产和生态环境带来的影响巨大。植物耐盐是一个多基因 ...

实验简介植物的基因组大小及 DNA 倍性和植物的品系、性状及营养和药用价值有密切联系。检测植物的基因组大小和 DNA 倍性在植物的鉴定、杂交育种等领域有重要意义。流式细胞仪可在半小时内完成从样本制备染色、植物基因组大小和 DNA 倍性测定全过程，以其方便快捷得到广泛应用。CytoFLEX 流式细胞仪具有优异的荧光分辨能力，可轻易区分不同大小的基因组，多达 10 的 7 次方线性检测范围，可更好地检测自然界或育种过程中广泛存在的多倍体现象。材料与方法▶ 试剂▶ ...

采用基因枪轰击的方法，用包裹质粒的金粉对洋葱表皮进行轰击，发现 GaMYB2-GFP 的融合表达载体只能在细胞核中能看到绿色荧光，这进一步证明该蛋白不具有跨膜蛋白结构，定位在细胞核中，具有转录因子的一般特征。

此次研究中，课题组创新性采用棉花花粉进行瞬时表达研究，缩短了实验周期，更快速获得转化植株，为基因功能的研究开辟了新思路。

生物碱是天然中药材中分量很重的一类活性成分，多具有显著而特殊的生理活性，在消炎、镇痛、降血压、抗癌等发面表现出越来越重要的药用价值。

鉴定蛋白激酶底物是蛋白激酶研究的一个主要焦点，并为解析信号转导途径及其复杂的调节提供证据。我们在此介绍一种以蛋白质芯片技术为基础的离体实验方法，用特异蛋白激酶对固定在芯片上的蛋白质进行系统磷酸化筛选。这种高通量方法可以用来鉴定可能的激酶底物。这个方法从包含数百个纯化重组的组氨酸标记蛋白质的植物蛋白质芯片开始，要用可溶解的、有活性的激酶，在具有放射性的 ATP 存在的环境下孵育芯片。一次芯片实验只需要少量有活性的激酶。然后用磷屏成像仪或 X 射线胶片检测放射性信号。在活体内激酶与底物不能相互作用时，鉴定到的可能的蛋白激酶底物必须通过其他的体外或体内的方法进行确定。此筛选方法可以通用于鉴定多种蛋白激酶的可能底物的直接鉴定。

拟南芥和水稻基因组测序项目的完成极大地支持了蛋白质组学方法的应用，如蛋白质芯片技术。在本章中，我们介绍一种植物蛋白质芯片的构建方法及其在单克隆抗体或多克隆血清的特异性和交叉反应研究方面的应用。此方法从已鉴定的编码携带 His 标签的植物蛋白质的大肠杆菌（K cDNA 表达克隆开始，用高通量技术表达和纯化这些重组蛋白质后，用接触点样机构建蛋白芯片。用一种抗 RGS-His6 抗体来检测芯片上的这些重组蛋白质，为了分析特异性抗体，首先将芯片浸泡在各自的抗体溶液中孵育，接着在带荧光标记的第二抗体溶液中孵育。用芯片扫描仪检测信号。包含植物全蛋白质组的蛋白质芯片将是未来用以检测抗体的特异性和交叉反应的理想芯片格式。

已有一种方法可用来从 SDS-PAGE 凝胶中提取完整蛋白质并对其进行 MALDI-TOF MS 分析，以确定其分子质量。这种方法包括一个电洗脱步骤以及在 MALDI-TOF 质谱分析之前的一个低温基质/ 分析物共结晶步骤。首先用电洗脱方法( ProteoPLUS )从聚丙烯酰胺凝胶中提取蛋白质。电洗脱之后，在相同的电洗脱管中，透析去除盐、SDS 和染料。真空离心浓缩蛋白质。以牛血清白蛋白 （ BSA )和磷酸酶 B( Phos B )做标准蛋白，结果发现，电洗脱比被动洗脱能更有效地从凝胶中提取完整蛋白质。优化后的蛋白质回收效率分别为：BSA 89% 和 Phos B 58%。此结果支持了回收效率与蛋白质大小负相关的假设。传统使用甲醇和乙酸“ 固定胶”的方法被认为会显著降低蛋白质回收效率，如果可能应避免这么做。下一步包括全蛋白与 MALDI 基质(反 3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸，齐子酸，10 mg/ml) 低温共结晶的样品制备过程中也要进一步去除杂质。蛋白质和 MALDI 基质经混合、密封后贮存于 4℃ 过夜共结晶。然后除去上清液，再用相同的基质溶液溶解蛋白质-基质结晶。用低温共

高分辨率的蛋白质分离是蛋白质组学研究的一个重要条件，蛋白质的分离主要依赖于 2D IEF/SDS-PAGE，不幸的是，这种技术分离疏水性蛋白质的能力较差，而且不能用于研究自然状态的非变性蛋白质。蓝绿非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)表现出一种可替代 2D IEF/SDS-PAGE 的蛋白质分离方法，这种方法基于用阴离子染料考马斯亮蓝将负电荷整合到蛋白质或蛋白复合物上，进行天然状态下的蛋白质分析。结合 SDS-PAGE 电泳，第一相蓝绿胶上被分离的蛋白复合物在第二相 SDS-PAGE 凝胶上被分离成其蛋白质亚基组分，在 2D 凝胶上形成竖条的点。2D 蓝绿胶 SDS-PAGE 是蛋白质组学研究中 2D IEF/SDS-PAGE 的理想补充技术。

像其他真核细胞一样，在植物细胞中，糖基化是被研究最多的翻译后事件之一。根据寡糖部分和蛋白质骨架之间的连接方式，可将糖基化分为两种类型：N-糖基化和O-糖基化。在此介绍我们实验室常用的研究植物蛋白质糖基化的几种不同的实验方法。这些方法依赖于糖特异探针的印记检测、糖蛋白的特异去糖基化以及质谱分析。通过这些实验，不仅可以确定一个蛋白质是不是糖蛋白，还可以确定糖蛋白是在哪个位置以及如何被糖基化的。本章最后部分介绍植物细胞中糖蛋白类群的特殊纯化和鉴定方法，称为糖蛋白质组学。

可逆的蛋白质的磷酸化作用参与植物细胞生理学的所有活动。由于用于研究磷酸化蛋白质的蛋白质组学和质谱技术的应用，使得这项具有高度挑战性的任务—揭示和分析植物中动态蛋白磷酸化网络的工作最近才开始成为可能的。蛋白质胰蛋白酶的剪切，色谱层析分离富含磷酸化肽段，质谱裂解和磷酸化肽段的序列分析为建立鉴定大部分目前已知的植物体内磷酸化蛋白质的实验方法打下了基础。当用胰蛋白酶消化单独分离出来的组分或不同的植物细胞器的蛋白质时，这个方法是最有效的。固相金属螯合亲和层析（IMAC )对富集复杂的蛋白质消化物被甲基化后生成的磷酸肽很有用。以下分离出来的磷酸肽的串联质谱分析得到了磷酸化蛋白质的鉴定和生物体内磷酸化位点的定位。个体蛋白质中修饰位点的磷酸化程度的相对定量分析可借助稳定同位素标记技术或专用的液相色谱-质谱方法完成。

PROTICdb 是一种主要为存储和分析通过 2D 聚丙烯酰胺电泳和质谱分析得到的植物蛋白质组数据的网络数据库。开发 PROTICdb 的目的是：①存储、跟踪、查询与蛋白质组学实验相关的信息，从组织取样到蛋白鉴定和定量分析；②将使用者的专业知识和其他来源的信息整合成一个用于支持数据分析的知识库（如用于等位基因变异或翻译后修饰产物的鉴定）。数据通过 Melanie，PDQuest，IM2d，ImageMaster(tm)2DPlatinum v5.0，Progenesis，Sequest，MS-Fit，Mascot 等软件处理之后可上传到 PROTICdb 关系型数据库中，也可以在网络上直接填写 （ 实验设计和方法）。2D 聚丙烯酰胺电泳注释图可以通过 GelBrowser 显示、查均和比对。定量数据可被方便地以列表形式导出，供任何第三方软件进行统计分析。PROTICdb 是基于 Oracle 或 PostgreSQLDataBase 管理系统，可从以下网址免费获取：http://cms.moulon.inra.fr/content/view/14/44/。

用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS)鉴定膜蛋白之前，需要将这些蛋白质分离出来用以质谱分析。用非变性去垢剂十二烷基-β-D-麦芽糖苷溶液增溶膜样品后，可用离子交换层析（IEC)分离膜蛋白质，并经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)，进一步分离蛋白质组分。根据膜蛋白质样品的复杂程度，可在 IEC/SDS-PAGE 之前，先使用凝胶过滤层析手段分离蛋白质。对最终获得的 SDS-PAGE 电泳胶板的染色，使我们能简单地建立起一个膜蛋白表达谱以及免疫抗原反应。此外，对疏水性膜镶嵌蛋白的胶内酶解也是很有必要的。通过上述这些分离步骤 ，最终可实现通过 MALDI-TOF-MS 对蛋白质的鉴定。本章介绍应用于植物、酵母质膜和植物液泡膜上的膜蛋白分离方法。

本章我们介绍运用 2D 液相色谱串联质谱大规模鉴定水稻叶片和根组织中的蛋白质的详细实验方法。该方法通过带有电喷雾发射喷器的纳升级流速双相层析柱（ 强阳离子交换/反相）来实现，这种技术的缩写名为 Mudpit( 多维蛋白鉴定技术）。这里介绍的实验方法包括从水稻植株收集叶片和根组织材料，从收集的叶片和根组织材料中提取蛋白质，提取出来的蛋白质的消化，制备带有整合电喷雾发射喷头的双相毛细管层析柱，运行数据依据性二维液相色谱-串联质谱分离多肽，使用数据库搜索得到的串联质谱数据鉴定多肽和蛋白质。这个方法不仅适用于多种植物材料，而且可用于鉴定植物特定组织、器官、细胞器或亚细胞器的蛋白质。本章除了介绍详细的实验方法外，还列举了一个具有代表性实验的结果，即用多维蛋白鉴定技术鉴定超过 1000 个的从水稻叶片和根样品中提取的蛋白质。

串联质谱是根据肽段的裂解规律（fragmentation pattern，也叫做 MS/MS 扫描）对肽段进行鉴定的有效技术。在串联质谱中，每一个肽片段都可以获得各自的光谱 ，从而可以根据肽段的特性对蛋白质进行鉴定。这个在自动采集数据方面的重要优势给液相色谱和串联质谱建立了有效的联系，而纳升级色谱柱和电喷雾电离的使用可大大增加该方法的有效性。利用这种技术现在可以大量鉴定出飞摩尔（fentomole)水平的肽段。MS/MS 光谱的批量处理可以产生一系列肽段，这些肽段对鉴定纯蛋白或蛋白质混合物具有较高的可信度。

MALDI-TOF 肽质量指纹图谱（PMF)是鉴定蛋白质较为快捷、方便的方法，所研究的基因组已经完成了测序和注释，蛋白质可以通过二维凝胶电泳分离和检测。研究植物蛋白质组有两个困难：一是只有少量植物完成了基因组测序，二是主要污染物来自于非植物本身。本章介绍了经典的“自下而上”的方法（即从多肽到蛋白识别）：凝胶切割，凝胶消化，肽回收和净化，MALDI-TOF 质谱，蛋白质数据库查询。

采用聚偏氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF )膜的免疫印迹技术是 Edman 测序最常用的方法。通过电转印，蛋白样品从 2D-聚丙烯酰胺（2D-PAGE)凝胶转移到 PVDF 膜上，装载蛋白的这种膜可直接用于蛋白测序。如果经几个循环而测序结果不理想时，可将 PVDF 膜从测序仪上取下，再用去封闭溶液（deblocking solution ) 处理该膜。当上述方法失败时，可采用其他方法如 Cleveland 法。由于 2D-PAGE 的分辨率高，综合运用 2D-PAGE、免疫印迹和 Edman 测序可大大提高蛋白测序的效率。

二维电泳作为比较蛋白质组学研究的一种重要实验手段，它的应用能够方便地反映出不同生理或遗传背景下蛋白相对量的变化差异。其结果的统计意义与不同的因素紧密相关，包括从实验设计到统计测试等各种因素。在这一章中我们描述了在实验的设计和图像采集过程中应该加以考虑的不同参数，并给出了不同程序使这些量化数据标准化和根据用户自定义标准来选择可重复性蛋白质点以及在质变和量变上显著不同的蛋白质点。

在本章中，我们提供了一个详细的方法来分析同一植物两个不同组织器官蛋白的差异表达。这个方法包括收集成熟番茄的叶和根，从收集的组织中制备蛋白质提取物，在差异凝胶电泳前荧光标记样本，一维和二维电泳分离以及图像定量差异蛋白表达量。这种方法广泛适用于植物材料并且可以用来研究植物应答生物胁迫、非生物胁迫、遗传操作、选育育种及其他方面的蛋白质表达差异。另外，除了具体阐述实验方法以外，我们还给出了一个具有代表性的分析番茄的根在盐处理及非处理情况下的蛋白表达微量变化的实验结果。