完整蛋白质从 SDS-PAGE 胶中的电洗脱及其 MALDI-TOF MS 分析
丁香园
3033
1. 前言
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS) 已经被广泛应用于生 物科学中。结合十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ) 和酶解消化，它提供了一种通过肽质量指纹谱（PMF ) 的快速、灵敏和准确鉴定蛋白质的方法通常 PMF 给出 10%~40% 的序列覆盖率。这样的覆盖率对于蛋白质鉴定来说已经足够，但它可能还不足以用来区分高度相似的蛋白质异构体。蛋白质异构体/同工酶广泛存在，它们通过 mRNA 的可变剪切或多基因家族生成。虽然它们在细胞中催化相同的反应，但是它们常常在不同的组织或生理条件下被差异表达。利用 PMF 区分蛋白质异构体有一定难度，因为能够区分不同异构体的特异性肽段可能无法从 10%~40% 的肽段覆盖中找到。由于许多要研究的物种尚缺乏完整基因组、mRNA 和（或）蛋白质序列，导致通过 PMF 区分异构体的工作更加复杂。
完整蛋白质分子质量的精确测定能为区分异构体提供额外的信息。实验证明，用 SDS-PAGE 鉴定完整蛋白质分子质量的精确度很低（约 10% 的误差），而且被测蛋白质和标准分子质量蛋白质之间的结构差异以及翻译后修饰导致修饰后的蛋白质在凝胶电泳时的不正常的迁移，使这种测定方法更加复杂。然而，现代的 MS 技术可提供 很高的分子质量精确度（0.1% 或更小的误差），是精确测定完整蛋白质分子质量的必选方法。
要精确测定由 SDS-PAGE 分离的完整蛋白质的分子质量，在很大程度上依赖于 SDS-PAGE 凝胶中蛋白质的提取。从凝胶中回收蛋白质要比回收胶内酶解后得到的肽段困难得多，几种从凝胶中提取完整蛋白质的方法已经报道了，大致分为三类：被动洗脱 [ 3~5 ] ，电洗脱 [ 6~8] 和电转移（或电印迹）到膜上。
Cohen 及其合作者 [3] 建立了一种利用非固定负染（Cu 或 Zn 染色）和有机溶剂提取蛋白质的被动洗脱技术。脱色后，蛋白质条带被从胶上切下，粉碎，并在提取液 [ 方法 A，蚁酸/水/异丙醇，3 : 2 : 1 ( V/V/V ) ] 或 MALDI 基质溶液 [ 方法 B，如 4-羟基-α- 氰基肉桂酸溶液（4HCCA ) ] 中剧烈振荡几个小时。利用这种技术能够提取分子质量在 70 kDa 以下的蛋白质。这种技术成功的关键是使用了非固定金属负染色。这样可以避免胶内蛋白质沉淀，从而获得更好的蛋白质回收效果。不幸的是，负染色相对较贵，考马斯亮蓝染色是一种廉价蛋白质染料，被广泛用于许多实验室。因此，一种从经考马斯亮蓝染色后的凝胶中提取蛋白质的方法会是经济实惠的。
Ehring 及其合作者报道了一种从经考马斯亮蓝染色后的凝胶中提取蛋白质的被动洗脱方法。他们用蚁酸/乙腈/异丙醇/水 [ 50 : 25 : 15 : 10 ( V/V/V/V) ] 代替蚁酸/水/异丙醇。加入乙腈被认为用来提高对疏水蛋白质的洗脱效果。这种方法虽然操作简单，但只能从经考马斯亮蓝染色后的凝胶中回收分子质量小于 30 kDa 的蛋白质。此外，暴露在蚁酸中过长的时间会引起丝氨酸和苏氨酸残基的甲酰化。为解决这个问题，Claverol 及其合作者报道了一种使用 SDS/乙酸钠缓冲液从考马斯亮蓝染色的凝胶中提取蛋白质的方法，将蛋白质条带浸泡在这个提取缓冲液中 37°C 过夜，使蛋白质扩散到缓冲液中，用亲水吸头（ZiptipHPL， Millipore， Bedford， MA) 去除考马斯亮蓝、SDS 和盐分。报道说这种方法可以回收分子质量在 45 kDa 以下的蛋白质，但用此方法回收更大的蛋白质仍然很困难。
将丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电转移（或电印迹）至膜上，如硝化纤维（NC) 或聚合体膜，是另一种回收完整蛋白质的方法。大部分膜与 MALDI-TOF MS 兼容，允许电印迹后直接分析完整蛋白质。对几种市售膜的系统研究显示用聚偏氟乙烯（PVDF) 和聚丙烯（PP ) 膜能获得最好的结果。但是，使用 UV-MALDI-TOF MS 时，光谱重复 性差，信噪比（S/N ) 低，而且分辨率低。过低的 S/N 比被认为与通常在 MALDITOF MS 中使用的紫外激光（355 nm) 的较浅的有效穿透深度（通常 200~300 nm) 有关。同时，蛋白质较牢地吸附在膜上也降低解吸附。使用 2.94 μm 的红外（IR ) 激光进行 MALDI-TOF MS 被证明效果较好。红外激光的有效穿透深度在 3~5 μm，因此能从 135 μm 厚度的膜上解吸附许多蛋白质。
然而，仍然需要指出的是：“ 还需要较大地提高 IR-M ALDI-TOF MS 谱的质量，特别是在影响分子质量测定精度的蛋白质信号峰宽方面” [12] 。直接将膜印迹的蛋白质溶解在基质溶液中的方法也已有报道 [ 10，11] 。通常用可溶解硝化纤维膜（NC) 的丙酮制备基质溶液，基质-蛋白质溶液被点在样品板上用于 MALDI-TOF MS 分析，获得更好的可靠性和重复性。但是，相对于那些包含洗脱和纯化蛋白质步骤的方法而言，此方法得到的蛋白质分辨率和精确度较低 [11] 。据推测，靶中含有的硝化纤维或蛋白质与硝化纤维的相互作用可能导致了分子质量精确度的降低。
用不同电压进行电洗脱提供了一种从 1D 或 2D 聚丙烯酰胺凝胶中提取蛋白质的快速和便捷的方法。实际上，电洗脱是电泳的延续，将蛋白质从凝胶中迁移到溶液中，接着盐、染料和 SDS 经过透析从电洗脱后的溶液中除去，然后浓缩纯化的蛋白质溶液。由于使用了不同的电压，蛋白质主动迁移而不是被动地扩散出凝胶，所以效率更髙，特别是用于洗脱大分子质量蛋白质时。已有几种不同的电洗脱方法报道，Clarke 等报道了一种一步微量电洗脱方法。Buzas 等建立了一种直接垂直电洗脱方法，此方法不需要从凝胶上切取蛋白质条带。
这些方法可获得很好的蛋白质回收率（最高达 90% )，但需要一些不易获得的特殊设备。Galvani 和他的同事 [ 14] 报道了使用市售电洗脱仪，Centrilutor(Amicon， Beverly，MA) ，提取蛋白质的方法。蛋白质首先被洗脱进 Centricon 旋转过滤器中，然后通过离心除去盐、染料和 SDS，并浓缩蛋白质。将此方法与超声波辅助被动洗脱方法相比较显示，电洗脱可回收高分子质量蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA ) 和磷酸酶 B，而被动洗脱无法提取到足够量的此类蛋白质供 MALDI-TOF MS 分析。但是，作者也指出，在检测小分子质量蛋白质时，被动洗脱可获得比电洗脱更好的质谱数据。这可能是由于电洗脱未能彻底地除去电泳缓冲液中的 SDS、染料和盐分。的确，在我们的实验中，经过过夜透析后的浓缩蛋白质样品中还可看到明显的蓝色，这说明那些成分去除不完全的 可能性。
在此，我们介绍用另一种市售电洗脱仪（ ProteoPLUS ) 来回收凝胶上的蛋白质， 然后经过一个低温蛋白质/基质共结晶步骤，进一步去除残留的杂质以增强 MALDITOF MS 信号。首先将蛋白质从凝胶中提取出来，在相同的电洗脱管中透析过夜，然后真空离心（SpeedVac) 浓缩。以牛血清白蛋白（BSA ) 和磷酸酶 B ( PhosB ) 为标准 样品，发现这种方法比被动洗脱的效果好。当凝胶上样量为5jug 时，回收效率分别为： BSA 8 9 % 和 PhosB 5 8 % ^ 被 动 洗 脱 （ 将捻碎的蛋白质条带浸泡在I X 电泳缓冲液过夜） 无法回收到磷酸酶B ，并且只能回收加样的 B S A 的 39 % ( 表 27-1)。在 进 行 MALDITOF M S 之前，将浓缩蛋白质与基质共结晶，进一步去除残留杂质。混合蛋白质溶液 和基质溶液[芥子酸，l 〇 mg/m L 溶于乙腈/水 （3 : 7)]，置 于 4° C 过夜，基质在低温下 的低溶解度导致蛋白质和基质的共结晶。丢弃含盐和染料的上清液，用相同的基质溶液 回收晶体。
? 292 ? 植物蛋白质组学实验指南
表 2 7 - 1 蛋白质回收的比较'
电洗脱/ % 被动洗脱/%
里曰质
固定 非固定 固定 非固定
磷酸酶B 6 58 未检出 未检出
牛血清白蛋白 66 89 未检出 39
a 固定表示用甲醇和乙酸固定液固定SD & PA GE 蛋白质；非固定表示不使用固定液；未检出表示在考马斯亮蓝 染色条件下未检出；凝胶加样量：5/ xl。数据显示增加的回收率与固定和电洗脱无关，蛋白质的回收率与蛋白质分 子质量成反比，如蛋白质分子质量增加，回收率就降低。
本实验方法用于分析由转基因小麦非原质体提取物中纯化得到的两种少1，3-内切 葡聚糖酶异构体[ 1 5 ] 。如 图 27-1所示，共结晶后 MALDI-TOF M S 的信号得到了显著的 增强。例如， / M ，3-内切葡聚糖酶异构体1 (G 1 ) 的 MALDI- T O F M S 信号增强了 3倍 ，而 ，1 ，3-内切葡聚糖酶异形体2 (G2 ) 的 MALDI- T O F M S 信号增强 7 倍 。这个 结果证明蛋白质和基质在低温（4° C ) 下共结晶去除残留的盐、去垢剂和考马斯亮蓝染 料 ，可有效地增强MALDI-TOF M S 信号。
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS) 已经被广泛应用于生 物科学中。结合十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ) 和酶解消化，它提供了一种通过肽质量指纹谱（PMF ) 的快速、灵敏和准确鉴定蛋白质的方法通常 PMF 给出 10%~40% 的序列覆盖率。这样的覆盖率对于蛋白质鉴定来说已经足够，但它可能还不足以用来区分高度相似的蛋白质异构体。蛋白质异构体/同工酶广泛存在，它们通过 mRNA 的可变剪切或多基因家族生成。虽然它们在细胞中催化相同的反应，但是它们常常在不同的组织或生理条件下被差异表达。利用 PMF 区分蛋白质异构体有一定难度，因为能够区分不同异构体的特异性肽段可能无法从 10%~40% 的肽段覆盖中找到。由于许多要研究的物种尚缺乏完整基因组、mRNA 和（或）蛋白质序列，导致通过 PMF 区分异构体的工作更加复杂。
完整蛋白质分子质量的精确测定能为区分异构体提供额外的信息。实验证明，用 SDS-PAGE 鉴定完整蛋白质分子质量的精确度很低（约 10% 的误差），而且被测蛋白质和标准分子质量蛋白质之间的结构差异以及翻译后修饰导致修饰后的蛋白质在凝胶电泳时的不正常的迁移，使这种测定方法更加复杂。然而，现代的 MS 技术可提供 很高的分子质量精确度（0.1% 或更小的误差），是精确测定完整蛋白质分子质量的必选方法。
要精确测定由 SDS-PAGE 分离的完整蛋白质的分子质量，在很大程度上依赖于 SDS-PAGE 凝胶中蛋白质的提取。从凝胶中回收蛋白质要比回收胶内酶解后得到的肽段困难得多，几种从凝胶中提取完整蛋白质的方法已经报道了，大致分为三类：被动洗脱 [ 3~5 ] ，电洗脱 [ 6~8] 和电转移（或电印迹）到膜上。
Cohen 及其合作者 [3] 建立了一种利用非固定负染（Cu 或 Zn 染色）和有机溶剂提取蛋白质的被动洗脱技术。脱色后，蛋白质条带被从胶上切下，粉碎，并在提取液 [ 方法 A，蚁酸/水/异丙醇，3 : 2 : 1 ( V/V/V ) ] 或 MALDI 基质溶液 [ 方法 B，如 4-羟基-α- 氰基肉桂酸溶液（4HCCA ) ] 中剧烈振荡几个小时。利用这种技术能够提取分子质量在 70 kDa 以下的蛋白质。这种技术成功的关键是使用了非固定金属负染色。这样可以避免胶内蛋白质沉淀，从而获得更好的蛋白质回收效果。不幸的是，负染色相对较贵，考马斯亮蓝染色是一种廉价蛋白质染料，被广泛用于许多实验室。因此，一种从经考马斯亮蓝染色后的凝胶中提取蛋白质的方法会是经济实惠的。
Ehring 及其合作者报道了一种从经考马斯亮蓝染色后的凝胶中提取蛋白质的被动洗脱方法。他们用蚁酸/乙腈/异丙醇/水 [ 50 : 25 : 15 : 10 ( V/V/V/V) ] 代替蚁酸/水/异丙醇。加入乙腈被认为用来提高对疏水蛋白质的洗脱效果。这种方法虽然操作简单，但只能从经考马斯亮蓝染色后的凝胶中回收分子质量小于 30 kDa 的蛋白质。此外，暴露在蚁酸中过长的时间会引起丝氨酸和苏氨酸残基的甲酰化。为解决这个问题，Claverol 及其合作者报道了一种使用 SDS/乙酸钠缓冲液从考马斯亮蓝染色的凝胶中提取蛋白质的方法，将蛋白质条带浸泡在这个提取缓冲液中 37°C 过夜，使蛋白质扩散到缓冲液中，用亲水吸头（ZiptipHPL， Millipore， Bedford， MA) 去除考马斯亮蓝、SDS 和盐分。报道说这种方法可以回收分子质量在 45 kDa 以下的蛋白质，但用此方法回收更大的蛋白质仍然很困难。
将丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电转移（或电印迹）至膜上，如硝化纤维（NC) 或聚合体膜，是另一种回收完整蛋白质的方法。大部分膜与 MALDI-TOF MS 兼容，允许电印迹后直接分析完整蛋白质。对几种市售膜的系统研究显示用聚偏氟乙烯（PVDF) 和聚丙烯（PP ) 膜能获得最好的结果。但是，使用 UV-MALDI-TOF MS 时，光谱重复 性差，信噪比（S/N ) 低，而且分辨率低。过低的 S/N 比被认为与通常在 MALDITOF MS 中使用的紫外激光（355 nm) 的较浅的有效穿透深度（通常 200~300 nm) 有关。同时，蛋白质较牢地吸附在膜上也降低解吸附。使用 2.94 μm 的红外（IR ) 激光进行 MALDI-TOF MS 被证明效果较好。红外激光的有效穿透深度在 3~5 μm，因此能从 135 μm 厚度的膜上解吸附许多蛋白质。
然而，仍然需要指出的是：“ 还需要较大地提高 IR-M ALDI-TOF MS 谱的质量，特别是在影响分子质量测定精度的蛋白质信号峰宽方面” [12] 。直接将膜印迹的蛋白质溶解在基质溶液中的方法也已有报道 [ 10，11] 。通常用可溶解硝化纤维膜（NC) 的丙酮制备基质溶液，基质-蛋白质溶液被点在样品板上用于 MALDI-TOF MS 分析，获得更好的可靠性和重复性。但是，相对于那些包含洗脱和纯化蛋白质步骤的方法而言，此方法得到的蛋白质分辨率和精确度较低 [11] 。据推测，靶中含有的硝化纤维或蛋白质与硝化纤维的相互作用可能导致了分子质量精确度的降低。
用不同电压进行电洗脱提供了一种从 1D 或 2D 聚丙烯酰胺凝胶中提取蛋白质的快速和便捷的方法。实际上，电洗脱是电泳的延续，将蛋白质从凝胶中迁移到溶液中，接着盐、染料和 SDS 经过透析从电洗脱后的溶液中除去，然后浓缩纯化的蛋白质溶液。由于使用了不同的电压，蛋白质主动迁移而不是被动地扩散出凝胶，所以效率更髙，特别是用于洗脱大分子质量蛋白质时。已有几种不同的电洗脱方法报道，Clarke 等报道了一种一步微量电洗脱方法。Buzas 等建立了一种直接垂直电洗脱方法，此方法不需要从凝胶上切取蛋白质条带。
这些方法可获得很好的蛋白质回收率（最高达 90% )，但需要一些不易获得的特殊设备。Galvani 和他的同事 [ 14] 报道了使用市售电洗脱仪，Centrilutor(Amicon， Beverly，MA) ，提取蛋白质的方法。蛋白质首先被洗脱进 Centricon 旋转过滤器中，然后通过离心除去盐、染料和 SDS，并浓缩蛋白质。将此方法与超声波辅助被动洗脱方法相比较显示，电洗脱可回收高分子质量蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA ) 和磷酸酶 B，而被动洗脱无法提取到足够量的此类蛋白质供 MALDI-TOF MS 分析。但是，作者也指出，在检测小分子质量蛋白质时，被动洗脱可获得比电洗脱更好的质谱数据。这可能是由于电洗脱未能彻底地除去电泳缓冲液中的 SDS、染料和盐分。的确，在我们的实验中，经过过夜透析后的浓缩蛋白质样品中还可看到明显的蓝色，这说明那些成分去除不完全的 可能性。
在此，我们介绍用另一种市售电洗脱仪（ ProteoPLUS ) 来回收凝胶上的蛋白质， 然后经过一个低温蛋白质/基质共结晶步骤，进一步去除残留的杂质以增强 MALDITOF MS 信号。首先将蛋白质从凝胶中提取出来，在相同的电洗脱管中透析过夜，然后真空离心（SpeedVac) 浓缩。以牛血清白蛋白（BSA ) 和磷酸酶 B ( PhosB ) 为标准 样品，发现这种方法比被动洗脱的效果好。当凝胶上样量为5jug 时，回收效率分别为： BSA 8 9 % 和 PhosB 5 8 % ^ 被 动 洗 脱 （ 将捻碎的蛋白质条带浸泡在I X 电泳缓冲液过夜） 无法回收到磷酸酶B ，并且只能回收加样的 B S A 的 39 % ( 表 27-1)。在 进 行 MALDITOF M S 之前，将浓缩蛋白质与基质共结晶，进一步去除残留杂质。混合蛋白质溶液 和基质溶液[芥子酸，l 〇 mg/m L 溶于乙腈/水 （3 : 7)]，置 于 4° C 过夜，基质在低温下 的低溶解度导致蛋白质和基质的共结晶。丢弃含盐和染料的上清液，用相同的基质溶液 回收晶体。
? 292 ? 植物蛋白质组学实验指南
表 2 7 - 1 蛋白质回收的比较'
电洗脱/ % 被动洗脱/%
里曰质
固定 非固定 固定 非固定
磷酸酶B 6 58 未检出 未检出
牛血清白蛋白 66 89 未检出 39
a 固定表示用甲醇和乙酸固定液固定SD & PA GE 蛋白质；非固定表示不使用固定液；未检出表示在考马斯亮蓝 染色条件下未检出；凝胶加样量：5/ xl。数据显示增加的回收率与固定和电洗脱无关，蛋白质的回收率与蛋白质分 子质量成反比，如蛋白质分子质量增加，回收率就降低。
本实验方法用于分析由转基因小麦非原质体提取物中纯化得到的两种少1，3-内切 葡聚糖酶异构体[ 1 5 ] 。如 图 27-1所示，共结晶后 MALDI-TOF M S 的信号得到了显著的 增强。例如， / M ，3-内切葡聚糖酶异构体1 (G 1 ) 的 MALDI- T O F M S 信号增强了 3倍 ，而 ，1 ，3-内切葡聚糖酶异形体2 (G2 ) 的 MALDI- T O F M S 信号增强 7 倍 。这个 结果证明蛋白质和基质在低温（4° C ) 下共结晶去除残留的盐、去垢剂和考马斯亮蓝染 料 ，可有效地增强MALDI-TOF M S 信号。
