利用纳升级液相色谱- 串联质谱进行蛋白质鉴定
丁香园
2242
1. 前言
蛋白质组学分析是一个多步骤的过程，通常涉及蛋白质的提取、分级、分离和质谱鉴定。分离蛋白质的首选是二维电泳。胶内消化、纯化的蛋白可以利用 MS 或 MS/MS ( 串联质谱）得到的肽段进行分析、鉴定。如果已知物种的基因全序列，则通常使用基质辅助激光解吸质谱法电离飞行时间（MALDI- TOF) 的 MS 光谱技术来进行分析。它是一种高通量鉴定蛋白质的方法，而且也不需要纯化肽段。另外，尽管 MS/MS 分析比较费时，但可以在没有数据库（从头测序）情况下识别单个肽段。理论上，利用 MS/MS 鉴定出的一个肽段就可足以找到相应的蛋白质，而实际上利用 MS 鉴定蛋白则至少需要 4 个或 5 个肽段和肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting) 。在只有不完整的序列数据库 [ 如只有表达序列标签（EST ) 数据库 ] 或只有其他物种的保守序列用于识别时，MS/MS 具有较大的便利性。与二维电泳相比，提出了另外一种简单水解蛋白质混合物的方法而不需要分离蛋白质：利用多维液相色谱（LC ) 和 MS/MS 用于分离复杂混合物和识别数千条多肽片段。这两种方法之间，中间的方法是使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDS-PAGE ) 凝胶电泳分离部分蛋白质和利用 LC-MS/MS 进行蛋白质鉴定 [ 4~6 ] 。
蛋白质组学的 MS/MS 主要采用配备一个电喷雾源的离子阱（IT ) 和四极杆飞行时间（Q-TOF) 仪器。电喷雾是利用质谱仪的金属喷针（needle) 和入口之间的电位差而产生的。这会导致喷针出口处的液滴带电。液滴蒸发成细小的喷射流后，质谱仪根据质荷比（m/Z) 可以检测离子（带电肽段）。在 Q-TOF 质谱仪中，第一个样品池将电喷雾源的离子转移到四级杆中。四级杆设置传输一个离子（前体离子）到碰撞池。在碰撞池中，前体离子进行裂解。裂解碎片（裂解离子）在另一个质量分析器（TOF 管）中进行分析。由于碎片是沿着肽段骨架裂解的，因此氨基酸序列可根据碎片离子扫描（MS/MS 扫描）进行测定。在离子阱 （IT ) 质谱仪中，离子的选择、片段裂解和片段分析都是在同一池子（离子阱）进行的。实际上，MS/MS 仪器可以进行 MS 和 MS/MS 之间的切换。当离子选择和碎片裂解关闭时，MS 就可以进行扫描。MS 扫描可以检测所有的肽段离子和进行片段裂解。
电喷雾对无机盐非常敏感，因此肽段样品上样之前必须进行脱盐处理。最有效的一种方法是使用反相高效液相色谱法（RP- HPLC) 。反相高效液相色谱法不仅可以去除盐类 ，而且还可以纯化和浓缩肽段样品。这就是为什么液相色谱- MS/MS (LC-MS/MS)是蛋白质组学中最常见的配制。由于电喷雾技术跟样品浓度高度相关，色谱柱的直径是主要参数，减少柱子的直径可以提高灵敏度 [7] 。目前用直径 50~100 μm 的纳米级色谱柱来提高质谱仪进样口的肽段浓度。此外，利用纳米级色谱柱将流量减少到 150~300 nl/min 也可以提髙电喷雾的有效性。
在过去的十几年中，nanoLOMS/MS 技术已被广泛使用。在大多数质谱实验室，它已成为一种普遍的技术。由于电喷雾电离（ESI) 不同于 MALDI 电离过程，因此分析出的肽段结果有所不同。这些差异可以解释为什么 nanoLC- MS/MS 是 MALDI-TOF 质谱分析的一个有效补充 [ 9，10 ]。
蛋白质组学分析是一个多步骤的过程，通常涉及蛋白质的提取、分级、分离和质谱鉴定。分离蛋白质的首选是二维电泳。胶内消化、纯化的蛋白可以利用 MS 或 MS/MS ( 串联质谱）得到的肽段进行分析、鉴定。如果已知物种的基因全序列，则通常使用基质辅助激光解吸质谱法电离飞行时间（MALDI- TOF) 的 MS 光谱技术来进行分析。它是一种高通量鉴定蛋白质的方法，而且也不需要纯化肽段。另外，尽管 MS/MS 分析比较费时，但可以在没有数据库（从头测序）情况下识别单个肽段。理论上，利用 MS/MS 鉴定出的一个肽段就可足以找到相应的蛋白质，而实际上利用 MS 鉴定蛋白则至少需要 4 个或 5 个肽段和肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting) 。在只有不完整的序列数据库 [ 如只有表达序列标签（EST ) 数据库 ] 或只有其他物种的保守序列用于识别时，MS/MS 具有较大的便利性。与二维电泳相比，提出了另外一种简单水解蛋白质混合物的方法而不需要分离蛋白质：利用多维液相色谱（LC ) 和 MS/MS 用于分离复杂混合物和识别数千条多肽片段。这两种方法之间，中间的方法是使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDS-PAGE ) 凝胶电泳分离部分蛋白质和利用 LC-MS/MS 进行蛋白质鉴定 [ 4~6 ] 。
蛋白质组学的 MS/MS 主要采用配备一个电喷雾源的离子阱（IT ) 和四极杆飞行时间（Q-TOF) 仪器。电喷雾是利用质谱仪的金属喷针（needle) 和入口之间的电位差而产生的。这会导致喷针出口处的液滴带电。液滴蒸发成细小的喷射流后，质谱仪根据质荷比（m/Z) 可以检测离子（带电肽段）。在 Q-TOF 质谱仪中，第一个样品池将电喷雾源的离子转移到四级杆中。四级杆设置传输一个离子（前体离子）到碰撞池。在碰撞池中，前体离子进行裂解。裂解碎片（裂解离子）在另一个质量分析器（TOF 管）中进行分析。由于碎片是沿着肽段骨架裂解的，因此氨基酸序列可根据碎片离子扫描（MS/MS 扫描）进行测定。在离子阱 （IT ) 质谱仪中，离子的选择、片段裂解和片段分析都是在同一池子（离子阱）进行的。实际上，MS/MS 仪器可以进行 MS 和 MS/MS 之间的切换。当离子选择和碎片裂解关闭时，MS 就可以进行扫描。MS 扫描可以检测所有的肽段离子和进行片段裂解。
电喷雾对无机盐非常敏感，因此肽段样品上样之前必须进行脱盐处理。最有效的一种方法是使用反相高效液相色谱法（RP- HPLC) 。反相高效液相色谱法不仅可以去除盐类 ，而且还可以纯化和浓缩肽段样品。这就是为什么液相色谱- MS/MS (LC-MS/MS)是蛋白质组学中最常见的配制。由于电喷雾技术跟样品浓度高度相关，色谱柱的直径是主要参数，减少柱子的直径可以提高灵敏度 [7] 。目前用直径 50~100 μm 的纳米级色谱柱来提高质谱仪进样口的肽段浓度。此外，利用纳米级色谱柱将流量减少到 150~300 nl/min 也可以提髙电喷雾的有效性。
在过去的十几年中，nanoLOMS/MS 技术已被广泛使用。在大多数质谱实验室，它已成为一种普遍的技术。由于电喷雾电离（ESI) 不同于 MALDI 电离过程，因此分析出的肽段结果有所不同。这些差异可以解释为什么 nanoLC- MS/MS 是 MALDI-TOF 质谱分析的一个有效补充 [ 9，10 ]。
