液相色谱-串联质谱法

1.样品收集

健康志愿者6名，其中男性3名，女性3名。志愿者受试前留取空白尿液； 口服120 mg DHEA片剂后,再收集0～24 h的尿液，于-20℃下保存。

2.样品处理

取尿液210 mL于试管中，加入5 ng甲基睾酮(内标)及210 mL pH6.8的磷酸缓冲液、150 μL β-葡萄糖醛酸甙酶(3 000 U)，于80℃恒温水浴中培养3 h，取出后冷却至室温。再加入3.5 mL乙醚，混旋，离心，取出有机相并于60℃水浴中挥干，残渣中加入100 μL 流动相溶解，供LC-MS/MS分析。

3.色谱及质谱条件

液相色谱：采用Cosmosil C18色谱柱(150 mm×2 mm，5μm )和Phenom enex C18预保护柱。流动相为甲醇-0.1%甲酸缓冲液(含0.02 mol/L乙酸铵) (体积比为68∶32) , 流速为200 μL/min。进样量为5 μL。

串联质谱：采用电喷雾电离源( ES I) ，在多反应监测(MRM )正离子模式下扫描。碰撞气(CAD )压力为48 263 Pa；气帘气(CUR)压力为68 948 Pa；雾化气(GS1)压力为241 317 Pa；辅助加热气(GS2)压力为275 790 Pa。喷雾电压为5 500 V；离子化温度( TEM )为500 ℃。

选取各目标物的两组特征母离子 /子离子对 ,分别优选其最佳碰撞电压 (CE)和去簇电压 (D P ) 。并采用丰度较强的一组母离子 /子离子对进行定量分析。

1. 液相色谱分离条件的优化是本研究的关键。睾酮与表睾酮、雄酮与苯胆烷醇酮均为同分异构体 ,具有相同的母离子和子离子 ,必须依靠色谱方法进行分离。

2. 每个目标物选取低、中、高 3种浓度的样品 ,以3种浓度样品与对应标准溶液测定结果相比求得回收率 ,并考察方法的精密度、准确度。