材料与仪器
修饰胰蛋白酶
消化缓冲液 萃取液 清洗液 脱色液
多通道移液枪 Eppendorf Repeater 分液器 Combitips 分液管
消化缓冲液 萃取液 清洗液 脱色液
多通道移液枪 Eppendorf Repeater 分液器 Combitips 分液管
步骤
3.1 胶内蛋白的水解和多肽的提取（一天的实验方案)
对于从 SDS-PAGE，2D-PAGE，BN-PAGE 电泳（经考马斯亮蓝 G-250 染色）得到的蛋白质 [11]，这个方案是可行、有效的。它不需要使用自动酶切仪（digestion robot) 。使用多通道移液枪和微孔板格式， 一天可以处理 96 个样品。标准的方法不需要对蛋白质进行还原和烷基化反应。这两个反应步骤比较花时间，但是对大部分的蛋白质鉴定没有影响，即使使用 SDS-PAGE 和 BN-PAGE 得到的样品。但根据我们的实验，这两个反应步骤似乎是角蛋白污染的一个重要来源。然而，在富含半胱氨 酸的情况下，蛋白质的还原和烷基化可能会增加蛋白质的覆盖率（见注释 1)。多通道的移液枪用于去除不同的液体，Eppendorf 分液器用来分配溶液。蛋白质的还原和 烷基化均须在 37°C 与搅拌情况下进行。
( 1 ) 将凝胶切块（直径 1.5 mm) 放入管子中。非液体凝胶可以在 4°C 存放数周，也可以在 -20°C 存放几个月。用油漆胶带进行密封。
( 2 ) 脱色：用 50 μl 脱色液处理 2 X 30 min。
( 3 ) 清洗：用 50 μl 洗涤液清洗 15 min。
( 4 ) 收缩：用 50 μl 收缩液处理 15 min。
( 5 ) 清洗：用 50 μl 洗涤液清洗 15 min。
( 6 ) 收缩：用 50 μl 收缩液处理 15 min。
( 7 ) 收缩：用 50 μl 收缩液处理 15 min。
( 8 ) 将胶条夹置于冰上 10 min 后，加入 5 μl 胰蛋白酶（20 ng/μl 酶解缓冲液），静置 10 min。然后将胶条夹置于热混合器上 4 h。经胰蛋白酶酶解 2 h 后添加 5 μl 酶解缓冲液，以弥补液体的挥发。
( 9 ) 提取 1 : 添加 15 μl 提取液，等待 15 min。转移提取物。
( 10 ) 提取 2 : 加 15 μl 乙腈，等待 15 min。转移提取物。
( 11 ) 干燥：在室温下蒸发过夜或使用 Spped VAC 干燥 30 min ( 见注释 2) 。
可选步骤：还原和烷基化
( 1 ) 用 10 mmol/L ( 1.5 mg/ml) DTT 和 55 mmol/L ( 10 mg/ml) 碘乙酰胺（IAA ) ( 溶在 50 mmol/L NH4HCO3) 处理可以进行还原和烷基化。
( 2 ) 在 20.3.1 中步骤 4 完成后，添加 25 μl 的 10 mmol/L DTT。在 56°C 下反应 1 h。
( 3 ) 取出液体，加入 25 μl 的 55 mmol/L IAA。让反应继续进行，在室温下暗中反应 45 min。移去液体，并转到 20.3.1 中步骤 5。
3.2 高效液相色谱和 ESI 设置
( 1 ) nanoLC 存在的主要问题是失准或出现坏的管切（tube cutting) 。这会导致时间延迟和稀释液体。如果在 75 μm 色谱柱和质谱仪之间存在死体积，会出现拖尾效应。如果在 75 μm 色谱柱之前存在死体积，则随着保留时间（retention time) 增 加，肽段会洗脱下来，但不会有严重的色谱退化。
( 2 ) 连接前，应用放大镜检查管路两端以确保它们是干净的而且垂直切割的。
( 3 ) 图 20-1 给出了配备有 RP 捕获柱和纳米柱的 nanoLC 示意图，将在下面的步骤描述。液体接头是用来提供电压。这种方法可以延长喷针的寿命（见注释 3)。
( 4 ) 从自动进样器到捕获柱，使用直径为 50 μm 的管子；从捕获柱到开关阀，使用直径 50 μm 的管子；从开关阀到分析柱，使用直径 20 μm 的管子；从分析柱到喷雾针，使用直径 20 μm 的管子。
( 5 ) 用 TEFZEL 密封垫，TEFZEL 套圈和 PEEK 螺母将毛细管连接到阀门端 口 ( 标准端口 1/16 英寸，1 英寸= 2. 54 cm) 。这些配件比不锈钢密封垫圈和螺母压力较低，但在紧固毛细管路时不容易破坏毛细管路。
( 6 ) LC Packings 公司的 nanoLC 柱配备了一个直径为 20 μm 的出口管。该管切成 3 cm ( 9 nl) 。使用一个聚四氟乙烯接头（特氟隆管，直径 300 μm ) 将管连接到纳米级喷雾针，这时缩短至 3 cm。这种连接在喷雾针堵塞时不能忍受压力。这个缺点也可能是优点：聚四氟乙烯接头泄漏意味着针尖堵塞，通常跟不规则的喷雾有关。
( 7 ) 使用液体接头（Microtee 连接器）提供电压。根据我们的经验，这是较强的配置。Microtee 放置在 75 μm 色谱柱前面，电极为铂丝（见注释 4) 。带有液体接头的喷雾针是不加涂层的（外径 360 μm，内径 20 μm，针头内径 10 μm ) 。
( 8 ) 如果泵装置采用的分流器只能提供一个 nl/min 的流速而没有流速检测器（旧版本的 LC Packings 仪器），则流速必须用连接到 75 μm 色谱柱的 25 μl 注射器进行检查。LC Packings 系统是 nanoLC，使用了 1: 1000 的分流。泵的流速在 150~250 μl/min 的 75 μm 色谱柱上应为 150~200 μl/min ( 见注释5) 。
3.3 HPLC 分离
( 1 ) 表 20-1 给出一个典型的 250 nl/min 速度梯度。该流程还可以优化：如在开始和再生过程中，流速可以为 300 nl/min 以减少延误；在肽段检测时，流速可以设置为 200 nl/min。这方面的发展在峰值驻留系统（peak packing system ) 中进行了优化 [12] 。
( 2 ) 在第 1 部分，从 0~3 min，阀门在位置 1一2 ( 见表 20-1 和图 20-1)。自动进样器注入 5 μl 的样品，样品以 7 μl/min 的流速加载和捕获于反相前置柱。在第 2 部分的开始，阀门转换到位置 10—1，将捕获柱和柱连接起来。然后样品使用反相过柱方式以 250 nl/min 的 nanoHPLC 梯度洗脱。第 3 部分是清洁柱子的再生步骤。
( 3 ) 梯度取决于柱子及其配件。应根据对照如牛血清白蛋白（BSA ) 的胰蛋白酶酶解产物（100~300 fmol 的注射量）进行调整。
( 4 ) 酶解产物溶解在 10~15 μl 的含有 TFA 的样品溶液中。TFA 在装载溶剂中作为离子配对试剂，因为与甲酸比较，它可以更好地捕获前置柱上的肽段。另外，甲酸作为高效液相色谱法溶剂 A 和 B 的添加剂，因为 TFA 强烈抑制电离。
( 5 ) 在这些条件下，一个完整的流程需要 45~50 min。图 20-2 是一个色谱图的例子，该图来自于一个复杂的多肽混合物。在 11~35 min 洗脱肽段。MS 基峰图类似于紫外图谱，借此可以检验分离的效果和质量。MS/MS 扫描的 TIC 显示了在多肽分离的范围内具有很高的信噪比。
3.4 质谱仪设置
( 1 ) 利用 nanoLC，只需 10~40 s 就能将多肽样品洗脱下来。因此，仪器在不到 10s 内就能完成一个循环（在 MS 模式和相关 MS/MS 扫描的一个核查扫描，摄入 survey scan) 。这里所描述的一些步骤，虽然是专门针对带有软件 Xcalibur 1.3 的 LCQIT，但主要原理对于所有的 MS/MS 仪器来说都是相同的：MS/MS 是数据依赖性，即在 MS 模式中若检测到了一个数据峰，MS/MS 就会自动采集数据。
( 2 ) Xcalibur —个高效的采集方法是 “ Nth”法 。这种方法是一个连续的 3 次扫描：① 全质谱扫描（m/z 350~1900 )；② 变焦扫描（ZoomScan) ( 扫描两个主要的具有较高分辨率的离子）；③ 这两个离子的 MS/MS ( 见注释 6) 。
( 3 ) 液体接头处的电离电压设置为 1.2~1.6 kV。如果需要增加超过 160 kV 的电压，一般表明喷针或缓冲液出现了问题。在这种情况下，首先更换纳流喷雾针，并用 1.3 kV 对其进行测试。如果问题仍然存在，则变换缓冲液 （ 见注释 7) 。
( 4 ) LCQ 仪器的裂解参数为 0.22，活化时间为 50 ms，碰撞能量为 35%~45%。Qz 从 0.25 降低至 0.22，意味着在 MS/MS 扫描中可以检测更小质量的肽段（见注释 8)。
( 5 ) 动态排除法可以用来防止对同一离子进行连续的 MS/MS 分析（见注释 9) 。
( 6 ) 排除列表是用来避免噪声分析。一些聚硅氧烷离子通常会出现在质量为 371 Th、445 Th 和 462 Th [13] 。
( 7 ) 采用 LCQIT、“ Nth” 法和 50 min 的采集时间，得到的原始文件大小大约是 12 Mo。
3.5 数据处理和解析
( 1 ) 数据分析是一个具有 3 个步骤的过程。
a. 第一步，从原始文件中提取 MS/MS 谱图并进行筛选。
b. 第二步，与从挑选的序列数据库中获得理论 MS/MS 谱图进行比较。对于一个实验 MS/MS 图谱，父本离子的质量是用来从数据库中提取 “同量异位的（ isobaric)” 的肽段。如果使用特定的酶如胰蛋白酶，只有那些具有特异性而能产生同量异位的肽段，才可以从数据库中提取出来。然后该软件根据裂解规则和 Roepstarff 和 Fohlman 提出的注释将 MS/MS 理论图谱中的肽段序列进行转换 [14] 。
c. 最后一步，是进行实验图谱与从序列数据库中获取的不同系列图谱之间的相关性分值的计算。这里的数据分析采用了 BIOWORKS 软件（以前为 Sequest) 。在这个软件中，相关性分值称为 XC。
( 2 ) 与埃德曼（Edman) 测序相反，鉴定的序列不是基于连续氨基酸的实际检测。如果数据库中没有完全一致的序列用于查询，则不可能进行肽段识别。而且，肽段识别是基于与已知序列的相关性进行的。与其他的算法类似，BIOWORKS 采用了得分制从而给出每个 MS/MS 谱中最可能的肽段 [ 15，16] 。这意味着一个错误的肽段序列也可能成为备选序列，这会导致错误的蛋白质鉴定。为了减少这个错误的发生，应当至少用两个 MS/MS 谱图去识别同一蛋白的两个肽段。
( 3 ) —般用已经测序的模式物种的蛋白质数据库来鉴定蛋白。对于其他物种，EST 重叠群数据库也是合适的（见注释 10)。在一些 FTP 站点可以获得蛋白质数据库和 EST 数据库（见注释 11)。
( 4 ) 数据库可以使用一个数据库的索引调整法进行预处理。此功能可以使查询时间减少 10 倍。不幸的是，索引调整固定了裂解的特异性和授权的质量修饰。如果选择索引调整数据库，可设置蛋氨酸氧化（ + 16 ) 为一个可变修饰（即蛋氨酸可被认为是氧化的）（见注释 12)。
( 5 ) MS/MS 谱图是根据 TIC 的强度和时间范围的时间间隔来提取的。如果在 20~40 min 范围洗脱肽段，则使用这些数值作为时间范围内的参数。必须按照正确 MS/MS 图谱的最小 TIC 来设置 TIC 强度（LCQ 通常为 1X105~5X105) 。MS/MS 提取可以产生 50~200 MS/MS 图谱。
( 6 ) 大规模样品数据采集可以在批量模式下进行样品处理。安装有 BIOWORKS 的电脑（Pentium 4 处理器和 512 MB DDR SDRAM 内存）利用 SWISS-PROT 数据库进行比较时，每个谱图需要 1~2s。进行 nanoLC 分析得到结果需要 1~2 min。
( 7 ) 首先，使用 SWISSPROT 数据库。该数据库可以检查角蛋白污染和胰蛋白酶肽段，库中包含了注释好的序列。
( 8 ) 其次，使用特定的植物数据库。如果使用 EST 数据库，软件将会翻译成蛋白质数据库。设置翻译码（frame of translation) 为 6 个可能性（三个正向和三个反向翻译码)。
( 9 ) 不同样品的对应结果都会存储在样品名称目录中。选择 Multiconsensus result 可以获取结果。
( 10 ) 根据 XC 的临界值 1.4~1.7，2~2.5 和 2.5~3 ( 分别对应带有1 个、2 个 和 3 个电荷的肽段）来筛选肽段鉴定。一些错误的肽标识也会保留在列表中。它们通常是一些嘈杂的光谱。这就解释了只有两个 MS/MS 光谱用于识别时为什么需要人工检查的原因。
( 11 ) 删除那些只有一个 MS/MS 图谱鉴定出的蛋白质。如果蛋白质是用两个 MS/MS 谱图鉴定的，人工检查一下实验谱图中强度最大的峰有没有用于匹配。
( 12 ) 如果 “没有酶” 选择作为查询参数以及胰蛋白酶用来酶解消化，检查候选肽段是否真的是胰蛋白肽段。此检查似乎是相关标准，应毫不含糊地验证识别。
( 13 ) 表 20-2 是一个 BIOWORKS 简要输出的例子，是二维凝胶的蛋白点在胶内胰蛋白酶消化后进行 nanoLC- MS/MS 分析结果。nanoLC-MS/MS 运行过程中产生的数百个 MS/MS 谱图，有足够强度可用来提取和用于数据库查询的还不到 100 个。用于查询的 EST 数据库没有索引，也没有酶的特异性，蛋氨酸氧化被认为是可变的。采用 XC 阈值来过滤肽段鉴定（XC 幅度高达 1.5、2 和 3) 。通过筛选的 19 个 MS/MS 图谱被确认为是胰蛋白肽段 （表 20-2)。没有指定某种酶进行搜索时，已鉴定肽段 C 端的赖氨酸或精氨酸参加增加了匹配的可信度。电荷值是父本离子的电荷。大多数的胰蛋白肽段带有两个电荷。然而，三个单电荷离子可识别具有显著 XC 值的肽段，并确认出双电荷获得离子的鉴定结果 （肽段 DTGLFGVYAVAK) 或识别新的肽段（ IDAVDASTVK 和VTEEDVIR) 。每个 MS/MS 谱图与几个肽段相关，但只有第一命中率的列在表 20-2。△Cn 是第一与第二命中率之间相关性的差值（XC1- XC2）/XC1，该值应大于 0.1。离子的数值是 MS/MS 图谱中实验离子的数目，与从肽序列预测的理论离子相匹配。例如，18/22 表明，在计算出的 22 个离子中，MS/MS 谱含有 18 个。在肽段序列，M * 对应蛋氨酸亚砜；蛋氨酸氧化后（+16 ) 的部分序列为 ILVANTAMDTDK 和 VVPEMVMAK。
对于从 SDS-PAGE，2D-PAGE，BN-PAGE 电泳（经考马斯亮蓝 G-250 染色）得到的蛋白质 [11]，这个方案是可行、有效的。它不需要使用自动酶切仪（digestion robot) 。使用多通道移液枪和微孔板格式， 一天可以处理 96 个样品。标准的方法不需要对蛋白质进行还原和烷基化反应。这两个反应步骤比较花时间，但是对大部分的蛋白质鉴定没有影响，即使使用 SDS-PAGE 和 BN-PAGE 得到的样品。但根据我们的实验，这两个反应步骤似乎是角蛋白污染的一个重要来源。然而，在富含半胱氨 酸的情况下，蛋白质的还原和烷基化可能会增加蛋白质的覆盖率（见注释 1)。多通道的移液枪用于去除不同的液体，Eppendorf 分液器用来分配溶液。蛋白质的还原和 烷基化均须在 37°C 与搅拌情况下进行。
( 1 ) 将凝胶切块（直径 1.5 mm) 放入管子中。非液体凝胶可以在 4°C 存放数周，也可以在 -20°C 存放几个月。用油漆胶带进行密封。
( 2 ) 脱色：用 50 μl 脱色液处理 2 X 30 min。
( 3 ) 清洗：用 50 μl 洗涤液清洗 15 min。
( 4 ) 收缩：用 50 μl 收缩液处理 15 min。
( 5 ) 清洗：用 50 μl 洗涤液清洗 15 min。
( 6 ) 收缩：用 50 μl 收缩液处理 15 min。
( 7 ) 收缩：用 50 μl 收缩液处理 15 min。
( 8 ) 将胶条夹置于冰上 10 min 后，加入 5 μl 胰蛋白酶（20 ng/μl 酶解缓冲液），静置 10 min。然后将胶条夹置于热混合器上 4 h。经胰蛋白酶酶解 2 h 后添加 5 μl 酶解缓冲液，以弥补液体的挥发。
( 9 ) 提取 1 : 添加 15 μl 提取液，等待 15 min。转移提取物。
( 10 ) 提取 2 : 加 15 μl 乙腈，等待 15 min。转移提取物。
( 11 ) 干燥：在室温下蒸发过夜或使用 Spped VAC 干燥 30 min ( 见注释 2) 。
可选步骤：还原和烷基化
( 1 ) 用 10 mmol/L ( 1.5 mg/ml) DTT 和 55 mmol/L ( 10 mg/ml) 碘乙酰胺（IAA ) ( 溶在 50 mmol/L NH4HCO3) 处理可以进行还原和烷基化。
( 2 ) 在 20.3.1 中步骤 4 完成后，添加 25 μl 的 10 mmol/L DTT。在 56°C 下反应 1 h。
( 3 ) 取出液体，加入 25 μl 的 55 mmol/L IAA。让反应继续进行，在室温下暗中反应 45 min。移去液体，并转到 20.3.1 中步骤 5。
3.2 高效液相色谱和 ESI 设置
( 1 ) nanoLC 存在的主要问题是失准或出现坏的管切（tube cutting) 。这会导致时间延迟和稀释液体。如果在 75 μm 色谱柱和质谱仪之间存在死体积，会出现拖尾效应。如果在 75 μm 色谱柱之前存在死体积，则随着保留时间（retention time) 增 加，肽段会洗脱下来，但不会有严重的色谱退化。
( 2 ) 连接前，应用放大镜检查管路两端以确保它们是干净的而且垂直切割的。
( 3 ) 图 20-1 给出了配备有 RP 捕获柱和纳米柱的 nanoLC 示意图，将在下面的步骤描述。液体接头是用来提供电压。这种方法可以延长喷针的寿命（见注释 3)。
( 4 ) 从自动进样器到捕获柱，使用直径为 50 μm 的管子；从捕获柱到开关阀，使用直径 50 μm 的管子；从开关阀到分析柱，使用直径 20 μm 的管子；从分析柱到喷雾针，使用直径 20 μm 的管子。
( 5 ) 用 TEFZEL 密封垫，TEFZEL 套圈和 PEEK 螺母将毛细管连接到阀门端 口 ( 标准端口 1/16 英寸，1 英寸= 2. 54 cm) 。这些配件比不锈钢密封垫圈和螺母压力较低，但在紧固毛细管路时不容易破坏毛细管路。
( 6 ) LC Packings 公司的 nanoLC 柱配备了一个直径为 20 μm 的出口管。该管切成 3 cm ( 9 nl) 。使用一个聚四氟乙烯接头（特氟隆管，直径 300 μm ) 将管连接到纳米级喷雾针，这时缩短至 3 cm。这种连接在喷雾针堵塞时不能忍受压力。这个缺点也可能是优点：聚四氟乙烯接头泄漏意味着针尖堵塞，通常跟不规则的喷雾有关。
( 7 ) 使用液体接头（Microtee 连接器）提供电压。根据我们的经验，这是较强的配置。Microtee 放置在 75 μm 色谱柱前面，电极为铂丝（见注释 4) 。带有液体接头的喷雾针是不加涂层的（外径 360 μm，内径 20 μm，针头内径 10 μm ) 。
( 8 ) 如果泵装置采用的分流器只能提供一个 nl/min 的流速而没有流速检测器（旧版本的 LC Packings 仪器），则流速必须用连接到 75 μm 色谱柱的 25 μl 注射器进行检查。LC Packings 系统是 nanoLC，使用了 1: 1000 的分流。泵的流速在 150~250 μl/min 的 75 μm 色谱柱上应为 150~200 μl/min ( 见注释5) 。
3.3 HPLC 分离
( 1 ) 表 20-1 给出一个典型的 250 nl/min 速度梯度。该流程还可以优化：如在开始和再生过程中，流速可以为 300 nl/min 以减少延误；在肽段检测时，流速可以设置为 200 nl/min。这方面的发展在峰值驻留系统（peak packing system ) 中进行了优化 [12] 。
( 2 ) 在第 1 部分，从 0~3 min，阀门在位置 1一2 ( 见表 20-1 和图 20-1)。自动进样器注入 5 μl 的样品，样品以 7 μl/min 的流速加载和捕获于反相前置柱。在第 2 部分的开始，阀门转换到位置 10—1，将捕获柱和柱连接起来。然后样品使用反相过柱方式以 250 nl/min 的 nanoHPLC 梯度洗脱。第 3 部分是清洁柱子的再生步骤。
( 3 ) 梯度取决于柱子及其配件。应根据对照如牛血清白蛋白（BSA ) 的胰蛋白酶酶解产物（100~300 fmol 的注射量）进行调整。
( 4 ) 酶解产物溶解在 10~15 μl 的含有 TFA 的样品溶液中。TFA 在装载溶剂中作为离子配对试剂，因为与甲酸比较，它可以更好地捕获前置柱上的肽段。另外，甲酸作为高效液相色谱法溶剂 A 和 B 的添加剂，因为 TFA 强烈抑制电离。
( 5 ) 在这些条件下，一个完整的流程需要 45~50 min。图 20-2 是一个色谱图的例子，该图来自于一个复杂的多肽混合物。在 11~35 min 洗脱肽段。MS 基峰图类似于紫外图谱，借此可以检验分离的效果和质量。MS/MS 扫描的 TIC 显示了在多肽分离的范围内具有很高的信噪比。
3.4 质谱仪设置
( 1 ) 利用 nanoLC，只需 10~40 s 就能将多肽样品洗脱下来。因此，仪器在不到 10s 内就能完成一个循环（在 MS 模式和相关 MS/MS 扫描的一个核查扫描，摄入 survey scan) 。这里所描述的一些步骤，虽然是专门针对带有软件 Xcalibur 1.3 的 LCQIT，但主要原理对于所有的 MS/MS 仪器来说都是相同的：MS/MS 是数据依赖性，即在 MS 模式中若检测到了一个数据峰，MS/MS 就会自动采集数据。
( 2 ) Xcalibur —个高效的采集方法是 “ Nth”法 。这种方法是一个连续的 3 次扫描：① 全质谱扫描（m/z 350~1900 )；② 变焦扫描（ZoomScan) ( 扫描两个主要的具有较高分辨率的离子）；③ 这两个离子的 MS/MS ( 见注释 6) 。
( 3 ) 液体接头处的电离电压设置为 1.2~1.6 kV。如果需要增加超过 160 kV 的电压，一般表明喷针或缓冲液出现了问题。在这种情况下，首先更换纳流喷雾针，并用 1.3 kV 对其进行测试。如果问题仍然存在，则变换缓冲液 （ 见注释 7) 。
( 4 ) LCQ 仪器的裂解参数为 0.22，活化时间为 50 ms，碰撞能量为 35%~45%。Qz 从 0.25 降低至 0.22，意味着在 MS/MS 扫描中可以检测更小质量的肽段（见注释 8)。
( 5 ) 动态排除法可以用来防止对同一离子进行连续的 MS/MS 分析（见注释 9) 。
( 6 ) 排除列表是用来避免噪声分析。一些聚硅氧烷离子通常会出现在质量为 371 Th、445 Th 和 462 Th [13] 。
( 7 ) 采用 LCQIT、“ Nth” 法和 50 min 的采集时间，得到的原始文件大小大约是 12 Mo。
3.5 数据处理和解析
( 1 ) 数据分析是一个具有 3 个步骤的过程。
a. 第一步，从原始文件中提取 MS/MS 谱图并进行筛选。
b. 第二步，与从挑选的序列数据库中获得理论 MS/MS 谱图进行比较。对于一个实验 MS/MS 图谱，父本离子的质量是用来从数据库中提取 “同量异位的（ isobaric)” 的肽段。如果使用特定的酶如胰蛋白酶，只有那些具有特异性而能产生同量异位的肽段，才可以从数据库中提取出来。然后该软件根据裂解规则和 Roepstarff 和 Fohlman 提出的注释将 MS/MS 理论图谱中的肽段序列进行转换 [14] 。
c. 最后一步，是进行实验图谱与从序列数据库中获取的不同系列图谱之间的相关性分值的计算。这里的数据分析采用了 BIOWORKS 软件（以前为 Sequest) 。在这个软件中，相关性分值称为 XC。
( 2 ) 与埃德曼（Edman) 测序相反，鉴定的序列不是基于连续氨基酸的实际检测。如果数据库中没有完全一致的序列用于查询，则不可能进行肽段识别。而且，肽段识别是基于与已知序列的相关性进行的。与其他的算法类似，BIOWORKS 采用了得分制从而给出每个 MS/MS 谱中最可能的肽段 [ 15，16] 。这意味着一个错误的肽段序列也可能成为备选序列，这会导致错误的蛋白质鉴定。为了减少这个错误的发生，应当至少用两个 MS/MS 谱图去识别同一蛋白的两个肽段。
( 3 ) —般用已经测序的模式物种的蛋白质数据库来鉴定蛋白。对于其他物种，EST 重叠群数据库也是合适的（见注释 10)。在一些 FTP 站点可以获得蛋白质数据库和 EST 数据库（见注释 11)。
( 4 ) 数据库可以使用一个数据库的索引调整法进行预处理。此功能可以使查询时间减少 10 倍。不幸的是，索引调整固定了裂解的特异性和授权的质量修饰。如果选择索引调整数据库，可设置蛋氨酸氧化（ + 16 ) 为一个可变修饰（即蛋氨酸可被认为是氧化的）（见注释 12)。
( 5 ) MS/MS 谱图是根据 TIC 的强度和时间范围的时间间隔来提取的。如果在 20~40 min 范围洗脱肽段，则使用这些数值作为时间范围内的参数。必须按照正确 MS/MS 图谱的最小 TIC 来设置 TIC 强度（LCQ 通常为 1X105~5X105) 。MS/MS 提取可以产生 50~200 MS/MS 图谱。
( 6 ) 大规模样品数据采集可以在批量模式下进行样品处理。安装有 BIOWORKS 的电脑（Pentium 4 处理器和 512 MB DDR SDRAM 内存）利用 SWISS-PROT 数据库进行比较时，每个谱图需要 1~2s。进行 nanoLC 分析得到结果需要 1~2 min。
( 7 ) 首先，使用 SWISSPROT 数据库。该数据库可以检查角蛋白污染和胰蛋白酶肽段，库中包含了注释好的序列。
( 8 ) 其次，使用特定的植物数据库。如果使用 EST 数据库，软件将会翻译成蛋白质数据库。设置翻译码（frame of translation) 为 6 个可能性（三个正向和三个反向翻译码)。
( 9 ) 不同样品的对应结果都会存储在样品名称目录中。选择 Multiconsensus result 可以获取结果。
( 10 ) 根据 XC 的临界值 1.4~1.7，2~2.5 和 2.5~3 ( 分别对应带有1 个、2 个 和 3 个电荷的肽段）来筛选肽段鉴定。一些错误的肽标识也会保留在列表中。它们通常是一些嘈杂的光谱。这就解释了只有两个 MS/MS 光谱用于识别时为什么需要人工检查的原因。
( 11 ) 删除那些只有一个 MS/MS 图谱鉴定出的蛋白质。如果蛋白质是用两个 MS/MS 谱图鉴定的，人工检查一下实验谱图中强度最大的峰有没有用于匹配。
( 12 ) 如果 “没有酶” 选择作为查询参数以及胰蛋白酶用来酶解消化，检查候选肽段是否真的是胰蛋白肽段。此检查似乎是相关标准，应毫不含糊地验证识别。
( 13 ) 表 20-2 是一个 BIOWORKS 简要输出的例子，是二维凝胶的蛋白点在胶内胰蛋白酶消化后进行 nanoLC- MS/MS 分析结果。nanoLC-MS/MS 运行过程中产生的数百个 MS/MS 谱图，有足够强度可用来提取和用于数据库查询的还不到 100 个。用于查询的 EST 数据库没有索引，也没有酶的特异性，蛋氨酸氧化被认为是可变的。采用 XC 阈值来过滤肽段鉴定（XC 幅度高达 1.5、2 和 3) 。通过筛选的 19 个 MS/MS 图谱被确认为是胰蛋白肽段 （表 20-2)。没有指定某种酶进行搜索时，已鉴定肽段 C 端的赖氨酸或精氨酸参加增加了匹配的可信度。电荷值是父本离子的电荷。大多数的胰蛋白肽段带有两个电荷。然而，三个单电荷离子可识别具有显著 XC 值的肽段，并确认出双电荷获得离子的鉴定结果 （肽段 DTGLFGVYAVAK) 或识别新的肽段（ IDAVDASTVK 和VTEEDVIR) 。每个 MS/MS 谱图与几个肽段相关，但只有第一命中率的列在表 20-2。△Cn 是第一与第二命中率之间相关性的差值（XC1- XC2）/XC1，该值应大于 0.1。离子的数值是 MS/MS 图谱中实验离子的数目，与从肽序列预测的理论离子相匹配。例如，18/22 表明，在计算出的 22 个离子中，MS/MS 谱含有 18 个。在肽段序列，M * 对应蛋氨酸亚砜；蛋氨酸氧化后（+16 ) 的部分序列为 ILVANTAMDTDK 和 VVPEMVMAK。
来源：丁香实验
