植物蛋白芯片的构建和抗原抗体相互作用的研究
丁香园
3558
1. 前言
蛋白质芯片包含几百甚至几千个已知的蛋白样品，这些蛋白样品有序、高密度排列在镀膜玻璃板上。利用这些蛋白质芯片可以对蛋白质的表达 [5~7] 和修饰 [ 8~ 11] 进行平行、快速和简易的分析，同时也可以用来检测这些蛋白质与抗体、其他蛋白 [ 16，17] 、DNA [ 18，19 ] 或其他小分子 [ 20，21 ] 之间的相互作用。已有一些研究工作使用蛋白质抗原芯片分析特异性抗体 [ 12，15 ] 或从患有不同疾病的病人中筛选血清 [ 15，22，23 ] 。蛋白质组芯片作为 一种理想的分析特异性抗体的格式被人们所重视 [13] 。为了在单个蛋白质芯片上分析几 种不同的抗体，可能需要运用不同的方法 [ 24，25 ] 。与 Western 印迹相比，运用蛋白质芯片分析抗体有一些优点 [13]，其中包括高灵敏度的蛋白质检测 [13，23] 。
蛋白质组学方法，如 2D 电泳/质谱（2-DE/MS ) 方法或是蛋白质芯片技术，在植物学领域中的应用越来越多 [ 26~32 ]。在此，我们介绍一种构建植物蛋白质芯片以及利用蛋白质芯片研究抗原抗体相互作用的方法。我们已成功地运用此方法构建了包含 96 个拟南芥蛋白质的第一个植物蛋白质芯片，当每个点的蛋白质最少含有 2~4 fmol 时，用 FAST 点样片基上的抗 RGS-His6 抗体就能检测出这些蛋白质 [14] 。利用这些蛋白质芯片，我们能显示单克隆抗 TCP 抗体、多克隆抗 MYB6 和抗 DOF11 的血清识别芯片上相对应的抗原，并且不和其他包括 DOF 和 MYB 转录因子在内的固定蛋白交叉反应。
本方法中，我们使用已鉴定的 cDNA 表达克隆，高通量表达和纯化带有 RGS-His6 标签的植物蛋白质，纯化得到的蛋白质自动排列在 FAST 点样片基上。这些蛋白质芯片与相应的的抗体一起孵育，然后再与带有荧光标记的第二抗体一起孵育。我们可通过检测、分析信号，鉴定那些与被测抗体互作的蛋白质。
2. 材料
2.1 高通量蛋白质表达和纯化
( 1 ) 细胞培养基：2 份 YT 或 LB 培养基包含 100 μg/ml 氨苄青霉素，15 μg/ml 卡那霉素和 2% 的葡萄糖。
( 2 ) 96 孔微量滴定板（Greiner bio-one，Frickenhausn，Germany ) 。
( 3 ) 384 孔微量滴定板（Gentix，Christchurch，UK ) 。
( 4 ) 96 孔深孔板：每孔容积 2 ml 的 96 孔微滴定板（Qiagen，Hilden，Germany) 。
( 5 ) 96 针复制器（Nunc，Wiesbaden，Germany) 。
( 6 ) 4 X SB 培养基：48 g/L 胰化蛋白胨，96 g/L 酵母提取物，0.8% ( V/V）甘油，120°C 高压灭菌 20 min。
( 7 ) 20 X PP 缓冲液（磷酸钾盐缓冲液）：17 mmol/L KH2PO4，72 mmol/L KH2PO4，用 0.2 μm 孔径的滤膜过滤灭菌。
( 8 ) 硫胺。
( 9 ) 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG；MBI Fermentas，St.Leon- Rot，Germany) 。
( 10 ) MultiScreenHTS 真空歧管（Millipore，Eschborn，Germany) 。
( 11 ) NiNTA 琼脂糖（NTA：氮川三乙酸镍；Qiagen) 。
( 12 ) 变性裂解缓冲液：100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L GuHCl，pH 8.0。
( 13 ) 洗涤缓冲液：100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 6.3。
( 14 ) 洗脱缓冲液：100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 4.5 ( 第 12~14 条，见注释 1)。
( 15 ) 96 孔微孔过滤板，无蛋白质结合的孔径为 0.65 μm 的 PVDF 膜（Millipore Multiscreen MADVN 6550)
( 16 ) B rad ford 试剂（Bio-Rad，Munich，Germany) 。
2.2 构建植物蛋白质芯片
( 1 ) 384 孔微孔板（Genetix) 。
( 2 ) FAST 点样基片（Whatman Schleicher& Schuell，Dassel，Germany) 。
( 3 ) Q 芯片分析系统（Genetix，NewMilton，UK ) 。
( 4 ) 小鼠、大鼠和兔子的免疫球蛋白抗体（Santa Cruz，Biotechnology，Santa Cruz，CA )。
2.3 蛋白芯片上的抗体筛选
( 1 ) 芯片扫描仪：428 Arrayscanner 扫描仪（Affimetrix，Palo Alto，CA ) 或 SeanArray 4000 扫描仪（ Perkinelmer Life Science，Cologne，Germany) 。
( 2 ) 盖载片（Carl Roth，Karlsruhe，Germany) 。
( 3 ) GenePixPro 4.0 软件。
1. 在 FAST 点样基片上的单克隆抗体筛选
( 1 ) TBS + Tween-20 ( TBST ) ：10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% ( V/V ) Tween-20。
( 2 ) 封闭液：2% 牛血清蛋白（BSA ) ( Sigma，St. Louis，MO) 溶于 TBST 中。
( 3 ) 小鼠抗 RGS-His6 抗体（Qiagen) 。
( 4 ) 特异单克隆抗体，如大鼠抗 CPI 抗体（Affinity Bioreagents，Cholden， USA ) 。
( 5 ) Cy3 标记的配体作为第二抗体，如兔抗小鼠 IgG 配抗 RGS-His6 —抗，或兔抗大鼠 IgG 配抗 TCP1 —抗（ Dianova，Hamburg，Germany) 。
2. 在 FAST 点样片基上的多克隆抗体筛选
( 1 ) TBS + Tween-20 ( TBST ) ：10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% ( V/V ) Tween-20。
( 2 ) 鱼胶（由深海鱼鱼皮制成）（ Sigma) 。
( 3 ) 多克隆大鼠血清，如抗 DOF11 或抗 MYB6 血清（Pineda, Berlin，Germany) 。
( 4 ) 羊抗兔免疫血清-Cy3 抗体（Dianova，Hamburg，Germany) 。
4. 注释
( 1 ) 在进行每次蛋白质纯化之前，要调节所用缓冲液的 pH。
( 2 ) 为了得到高浓度的特异重组蛋白提取物（如在低拷贝质粒上重组蛋白质）用于随后的蛋白质纯化，我们可以同时用 100 μl 裂解液分别裂解两个相同的 1 ml 培养物的沉淀物，合并得到 200 μl 裂解物，供下一步分析 [15]。
( 3 ) 小心吸取上清液，只将那些澄清的上清液转移到过滤板上，以确保在随后的过滤中板不会被堵塞。
( 4 ) 使用适用于微孔板的真空泵。
( 5 ) 确保在过滤后没有液体残留在过滤板下面；如果有的话，必须手动清除。为了避免这个问题的出现，过滤要在足够的真空压下尽快进行（要快速建立真空且持续时间不要过长，否则，过滤板就会过于渗漏）。
( 6 ) 另一个高通量纯化蛋白质的方法就是应用 Qiagen BioRobot 8000 和 Ni-NTA Superflow 96 BioRobotKit (Qiagen) 系统 [14]，使用与手工纯化相同的缓冲液来裂解、冲洗和洗脱 （见 28.2.1)。与手工纯化方法相比，机器自动纯化方法的劣势就是实验药品消耗较大，以及洗脱体积无法调节到低于 350 μl。用手工纯化方法，洗脱体积可从 30~80 μl，较小的洗脱体积有利于纯化那些表达量较小的蛋白质。
( 7 ) 在 FAST 片基表面涂上一层硝酸纤维素衍生的聚合物，就表面结构来说，它们属于 3D 芯片，比 2D 芯片具有更强的固定能力。在使用单克隆抗体进行抗原-抗体相互作用的研究中，除了使用 FAST 片基外，我们还使用了自制的 PAA 片基。PAA 片基是根据已报道的方法制备的 [ 15，41] 。Angenendt 及其同事比较了用于抗原-抗体相互作用研究的不同芯片表面材料的特性 [ 41，42] 。我们综述了不同芯片表面材料在包括抗原-抗体相互作用在内的不同芯片的应用 [2] 。
( 8 ) 将无蛋白质溶液（洗脱缓冲液，PBS ) 和一个不含 RGS6 标记的无关蛋白质 ( BSA ) 作为负对照，我们用 Cy3 标记的二抗（如小鼠 IgG-Cy3 二抗）作为正对照。为了检测二抗的结合效果，我们点样相应的单克隆一抗和同物种的 IgG ( 如与小鼠抗 RGS-His6 抗体一起做筛选实验的小鼠 IgG，或与多克隆血清一起做筛选实验的大鼠 IgG ) 用来作为额外的正对照。
( 9 ) 根据需要分析的蛋白质数量及其重复数目，决定用于抗原-抗体相互作用研究的芯片点样模式。那些能用荧光检测分辨出来的点的最大点样密度主要依赖于点样方法和芯片扫描仪的分辨率。当我们采用我们自己的点样方法，分辨率为 10 μm 的扫描仪，点样模式为 14 X 14 ( 点间距为 321 μm ) 或 15 X 15 ( 点间距是 300 μm) 时 ，我们可获得足以判定荧光信号的分辨率（数据未显示）。至今我们还没有实验更大的点样模式。Lueking 和他的同事[ 15 ] 成功地使用 PAA 片基，用相同的点样方法，成功地以 13 X 13 的点样模式在同一个点上反复点样 5 次 ，用荧光检测进行抗体-抗原相互作用的研究。Michaud 和他的同事甚至用更高的点样密度（16 X 18 ) 的蛋白质芯片和荧光检测来分析抗体。除了其他方面的应用，我们还综述了运用蛋白质芯片进行不同抗原-抗体相互作用的研究 [2] 。
( 10 ) 我们在进行“原则证明”性研究分析植物抗体时，以 4 X 4 水平方向上重复 2 次点样模式，点间距为 1050 μm [14] ，在片基上的两个相同区域点样。
( 11 ) 如果在文献中未查到最佳抗体稀释比例，可在芯片研究工作开始之前，通过 Western 印迹实验来确定。
( 12 ) 为了防止芯片在与抗体孵育的过程中干燥，我们把芯片放在用 TBST 润湿的 Whatman 滤纸上。
( 13 ) 由于二抗被突光标记，因此，这一步骤以及其后的每个步骤实验均需在黑暗中进行。
( 14 ) 荧光标记的二抗 4°C 下保存，或加入甘油（终浓度为 50% ) 保存在 一20°C。
( 15 ) 我们采用另一种在 FAST 片基上筛选单克隆抗体的方法：FAST 片基室温下，用 1 X PBS、0.5% ( V/V ) Tween-20 溶液封闭 2 h。将适当的单克隆抗体稀释液在室温下孵育芯片 2 h，然后用封闭液冲洗两次，每次 10 min。用相应的 Cy3 标记二抗 ( 与一抗物种特异性主相关）室温下进一步孵育 FAST 片基 1 h。在信号检测之前，片基在室温下用 1 X PBS/0.5% ( V/V ) Tween-20 冲洗两次，每次 30 min，然后用 1X PBS 冲洗两次，每 次 20 min。
如果使用单克隆抗 Phy B 抗体 Pea-25 [43]，只能用本方法在 FAST 片基上检测 PhyB [ 14 ] 。用在 28.3.3 节 1 中介绍的方法，我们检测不到 PhyB。
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蛋白质组学方法，如 2D 电泳/质谱（2-DE/MS ) 方法或是蛋白质芯片技术，在植物学领域中的应用越来越多 [ 26~32 ]。在此，我们介绍一种构建植物蛋白质芯片以及利用蛋白质芯片研究抗原抗体相互作用的方法。我们已成功地运用此方法构建了包含 96 个拟南芥蛋白质的第一个植物蛋白质芯片，当每个点的蛋白质最少含有 2~4 fmol 时，用 FAST 点样片基上的抗 RGS-His6 抗体就能检测出这些蛋白质 [14] 。利用这些蛋白质芯片，我们能显示单克隆抗 TCP 抗体、多克隆抗 MYB6 和抗 DOF11 的血清识别芯片上相对应的抗原，并且不和其他包括 DOF 和 MYB 转录因子在内的固定蛋白交叉反应。
本方法中，我们使用已鉴定的 cDNA 表达克隆，高通量表达和纯化带有 RGS-His6 标签的植物蛋白质，纯化得到的蛋白质自动排列在 FAST 点样片基上。这些蛋白质芯片与相应的的抗体一起孵育，然后再与带有荧光标记的第二抗体一起孵育。我们可通过检测、分析信号，鉴定那些与被测抗体互作的蛋白质。
2. 材料
2.1 高通量蛋白质表达和纯化
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( 3 ) 384 孔微量滴定板（Gentix，Christchurch，UK ) 。
( 4 ) 96 孔深孔板：每孔容积 2 ml 的 96 孔微滴定板（Qiagen，Hilden，Germany) 。
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( 7 ) 20 X PP 缓冲液（磷酸钾盐缓冲液）：17 mmol/L KH2PO4，72 mmol/L KH2PO4，用 0.2 μm 孔径的滤膜过滤灭菌。
( 8 ) 硫胺。
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( 13 ) 洗涤缓冲液：100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 6.3。
( 14 ) 洗脱缓冲液：100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L 尿素，pH 4.5 ( 第 12~14 条，见注释 1)。
( 15 ) 96 孔微孔过滤板，无蛋白质结合的孔径为 0.65 μm 的 PVDF 膜（Millipore Multiscreen MADVN 6550)
( 16 ) B rad ford 试剂（Bio-Rad，Munich，Germany) 。
2.2 构建植物蛋白质芯片
( 1 ) 384 孔微孔板（Genetix) 。
( 2 ) FAST 点样基片（Whatman Schleicher& Schuell，Dassel，Germany) 。
( 3 ) Q 芯片分析系统（Genetix，NewMilton，UK ) 。
( 4 ) 小鼠、大鼠和兔子的免疫球蛋白抗体（Santa Cruz，Biotechnology，Santa Cruz，CA )。
2.3 蛋白芯片上的抗体筛选
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( 2 ) 封闭液：2% 牛血清蛋白（BSA ) ( Sigma，St. Louis，MO) 溶于 TBST 中。
( 3 ) 小鼠抗 RGS-His6 抗体（Qiagen) 。
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( 5 ) Cy3 标记的配体作为第二抗体，如兔抗小鼠 IgG 配抗 RGS-His6 —抗，或兔抗大鼠 IgG 配抗 TCP1 —抗（ Dianova，Hamburg，Germany) 。
2. 在 FAST 点样片基上的多克隆抗体筛选
( 1 ) TBS + Tween-20 ( TBST ) ：10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，0.1% ( V/V ) Tween-20。
( 2 ) 鱼胶（由深海鱼鱼皮制成）（ Sigma) 。
( 3 ) 多克隆大鼠血清，如抗 DOF11 或抗 MYB6 血清（Pineda, Berlin，Germany) 。
( 4 ) 羊抗兔免疫血清-Cy3 抗体（Dianova，Hamburg，Germany) 。
4. 注释
( 1 ) 在进行每次蛋白质纯化之前，要调节所用缓冲液的 pH。
( 2 ) 为了得到高浓度的特异重组蛋白提取物（如在低拷贝质粒上重组蛋白质）用于随后的蛋白质纯化，我们可以同时用 100 μl 裂解液分别裂解两个相同的 1 ml 培养物的沉淀物，合并得到 200 μl 裂解物，供下一步分析 [15]。
( 3 ) 小心吸取上清液，只将那些澄清的上清液转移到过滤板上，以确保在随后的过滤中板不会被堵塞。
( 4 ) 使用适用于微孔板的真空泵。
( 5 ) 确保在过滤后没有液体残留在过滤板下面；如果有的话，必须手动清除。为了避免这个问题的出现，过滤要在足够的真空压下尽快进行（要快速建立真空且持续时间不要过长，否则，过滤板就会过于渗漏）。
( 6 ) 另一个高通量纯化蛋白质的方法就是应用 Qiagen BioRobot 8000 和 Ni-NTA Superflow 96 BioRobotKit (Qiagen) 系统 [14]，使用与手工纯化相同的缓冲液来裂解、冲洗和洗脱 （见 28.2.1)。与手工纯化方法相比，机器自动纯化方法的劣势就是实验药品消耗较大，以及洗脱体积无法调节到低于 350 μl。用手工纯化方法，洗脱体积可从 30~80 μl，较小的洗脱体积有利于纯化那些表达量较小的蛋白质。
( 7 ) 在 FAST 片基表面涂上一层硝酸纤维素衍生的聚合物，就表面结构来说，它们属于 3D 芯片，比 2D 芯片具有更强的固定能力。在使用单克隆抗体进行抗原-抗体相互作用的研究中，除了使用 FAST 片基外，我们还使用了自制的 PAA 片基。PAA 片基是根据已报道的方法制备的 [ 15，41] 。Angenendt 及其同事比较了用于抗原-抗体相互作用研究的不同芯片表面材料的特性 [ 41，42] 。我们综述了不同芯片表面材料在包括抗原-抗体相互作用在内的不同芯片的应用 [2] 。
( 8 ) 将无蛋白质溶液（洗脱缓冲液，PBS ) 和一个不含 RGS6 标记的无关蛋白质 ( BSA ) 作为负对照，我们用 Cy3 标记的二抗（如小鼠 IgG-Cy3 二抗）作为正对照。为了检测二抗的结合效果，我们点样相应的单克隆一抗和同物种的 IgG ( 如与小鼠抗 RGS-His6 抗体一起做筛选实验的小鼠 IgG，或与多克隆血清一起做筛选实验的大鼠 IgG ) 用来作为额外的正对照。
( 9 ) 根据需要分析的蛋白质数量及其重复数目，决定用于抗原-抗体相互作用研究的芯片点样模式。那些能用荧光检测分辨出来的点的最大点样密度主要依赖于点样方法和芯片扫描仪的分辨率。当我们采用我们自己的点样方法，分辨率为 10 μm 的扫描仪，点样模式为 14 X 14 ( 点间距为 321 μm ) 或 15 X 15 ( 点间距是 300 μm) 时 ，我们可获得足以判定荧光信号的分辨率（数据未显示）。至今我们还没有实验更大的点样模式。Lueking 和他的同事[ 15 ] 成功地使用 PAA 片基，用相同的点样方法，成功地以 13 X 13 的点样模式在同一个点上反复点样 5 次 ，用荧光检测进行抗体-抗原相互作用的研究。Michaud 和他的同事甚至用更高的点样密度（16 X 18 ) 的蛋白质芯片和荧光检测来分析抗体。除了其他方面的应用，我们还综述了运用蛋白质芯片进行不同抗原-抗体相互作用的研究 [2] 。
( 10 ) 我们在进行“原则证明”性研究分析植物抗体时，以 4 X 4 水平方向上重复 2 次点样模式，点间距为 1050 μm [14] ，在片基上的两个相同区域点样。
( 11 ) 如果在文献中未查到最佳抗体稀释比例，可在芯片研究工作开始之前，通过 Western 印迹实验来确定。
( 12 ) 为了防止芯片在与抗体孵育的过程中干燥，我们把芯片放在用 TBST 润湿的 Whatman 滤纸上。
( 13 ) 由于二抗被突光标记，因此，这一步骤以及其后的每个步骤实验均需在黑暗中进行。
( 14 ) 荧光标记的二抗 4°C 下保存，或加入甘油（终浓度为 50% ) 保存在 一20°C。
( 15 ) 我们采用另一种在 FAST 片基上筛选单克隆抗体的方法：FAST 片基室温下，用 1 X PBS、0.5% ( V/V ) Tween-20 溶液封闭 2 h。将适当的单克隆抗体稀释液在室温下孵育芯片 2 h，然后用封闭液冲洗两次，每次 10 min。用相应的 Cy3 标记二抗 ( 与一抗物种特异性主相关）室温下进一步孵育 FAST 片基 1 h。在信号检测之前，片基在室温下用 1 X PBS/0.5% ( V/V ) Tween-20 冲洗两次，每次 30 min，然后用 1X PBS 冲洗两次，每 次 20 min。
如果使用单克隆抗 Phy B 抗体 Pea-25 [43]，只能用本方法在 FAST 片基上检测 PhyB [ 14 ] 。用在 28.3.3 节 1 中介绍的方法，我们检测不到 PhyB。
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