材料与仪器
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
PP 缓冲液 变性裂解缓冲液
微量滴定板
PP 缓冲液 变性裂解缓冲液
微量滴定板
步骤
3.1 高通量蛋白的表达和纯化
我们用在 PQE30 表达载体里构建的，可表达带 N 端 RGS-His6 标记的大肠杆菌 cDNA 表达克隆来生产重组植物蛋白。由于超出本章节的范围，我们不在此详细叙述这种表达克隆的产生过程，只是简要地概括一下。从下列的 cDNA 表达库中，我们也许能获得以上所述的植物表达克隆：在表达载体 PQE30NST ( 检索号：AF074376 ) 中构建的大麦表达库和在 pQE30NAST attB 载体（检索号：AF386205 ) 中构建的拟南芥表达库。这些表达库已经按照 Konrad Buessow 研究小组的方法，用脱氧胸腺嘧啶脱氧寡核苷酸作引物，生产具有完整 N 端的重组蛋白 [ 34~36] 。我们用全长拟南芥克隆作为植物蛋白表达克隆的另一个来源，这个全长拟南芥克隆是通过用基因特异引物限制性依赖克隆，或用 GATEWAY 克隆技术重组依赖性克隆，进行可读框直接克隆获得的。
为了从上述这些资源中高通量和小规模表达植物蛋白质，我们采用如下方法。
蛋白质表达
( 1 ) 在孔体积为 2 ml 的 96 孔深孔板上加满附加了 2% 葡萄糖，100 μg/ml 氨苄青霉素和 15 μg/ml 卡那霉素的 100 μl 2YT 培养基。
( 2 ) 重组克隆培养物从之前保存在 -80°C 的 384 或 96 孔微孔板上接种出来，接种时要用 96 针复制器。
( 3 ) 培养物在 37°C 剧烈振摇（320 r/min ) 生长 16 h 后，加入 900 μl 预先加热的培养基（1X SB 培养基，附加了 100 μg/ml 氨苄青霉素，15 μg/ml 卡那霉素，20 μg/ml 硫胺的 1X PP 缓冲液），然后继续培养 2 h。
( 4 ) 为了诱导蛋白质表达，加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，并继续培养 4~5 h。
( 5 ) 4°C，1500 g 离心 10 min，收集细胞，沉淀物于 -80°C 下保存。
( 6 ) 取出一部分收获细胞的裂解产物在 15% 的聚丙烯酰胺凝胶上检测蛋白质表达效率（图 28-1)。
蛋白质纯化
( 1 ) 首先，在解冻的沉淀物中加入 150 μl 的变性裂解缓冲液，剧烈涡旋振荡溶解沉淀物，然后室温下振摇（约 650 r/min) 孵育 30 min ( 见注释2) 。
( 2 ) 1900 g 离心裂解细胞。上清液转移到 96 孔滤板上（见注释 3 )，并且用真空抽滤盒（vacuummanifold) 迅速吸入到一新鲜滤板上（见注释 4 和注释 5) 。
( 3 ) 接着在每个孔中加入 30 μl NiNTA-琼脂糖（1 : 2 稀释于裂解液中），用胶带密封，室温下，300 r/min 振摇 1 h，使组氨酸标记物与蛋白质结合。
( 4 ) 用 100 μl 的洗涤缓冲液重悬、洗涤琼脂糖微球，振摇 5 min，重复 3 次，然后将上清液转移到真空歧管中（见注释 5) 。
( 5 ) 最后，用 80 μl 的洗脱液静止孵育琼脂糖微球 20 min，将蛋白质从琼脂糖微球中洗脱出来，洗脱液过滤转移到一个新鲜的 96 孔板上（见注释 6)。
( 6 ) 蛋白质在 4°C 下保存。
( 7 ) 纯化的蛋白质可被分离，如用 15% 的聚丙烯酰胺凝胶（图 28-2)。蛋白浓度用 Bradford 蛋白质分析方法确定。
运用上述方法，我们获得了平均浓度约为 100 μg/ml 的纯化蛋白质（数据未显示）。
3.2 构建植物蛋白质芯片
我们将 FAST 点样片基用作构建植物蛋白质芯片的表面，进行抗体分析或蛋白磷酸化研究 ( 见第 29 章 ) 。
( 1 ) 在构建芯片之前，先将 20 μl 的纯化植物蛋白和对照（见注释 8 ) 转移到 384 孔板上。
( 2 ) FAST 芯片片基放在 QArmy 芯片检测系统上，此芯片检测系统带湿度控制器 ( 65%~70% ) 和 16 个顶端直径为 150 μm 的钝头不镑钢，针距为 4.5 mm。我们采用 120 μm 的点深度。
( 3 ) 每个样品上样一次，每个点上样量为 0.6 nL。
( 4 ) 每一次点样后，点样器要用双蒸水清洗（6 s )，热风机吹干（2 s ) ，再用 80% 的乙醇清洗（6 s ) ，再次吹干，防止交叉污染。
( 5 ) 蛋白质芯片在密闭的片基盒中，4°C 保存。
蛋白质可以不同的模板形式点样，如 4 X 4 、8 X 8 、10 X 10 等（见注释 9) 。同样， 蛋白质也可以重复点样，如 2 次 ，4 次或多次等。研究抗体和抗原之间的相互作用，建议在两个相同的区域在水平方向上点样 2 次（见注释 10)。
用这个方法构建的植物蛋白质芯片可用来进行抗体分析研究，在 4°C 保存时至少能在 3 星期内提供可重复的结果。此外，这种植物蛋白质芯片还可用于蛋白激酶磷酸化的研究 [ 8，33] ，本书中已有详细的介绍（见第 29 章 ) 。
为了检测固定在蛋白质芯片片基上的重组植物蛋白，按照如下方法（见 28.3.3 节 1 ) 将芯片片基孵育在抗 RGS-His6 的抗体中。图 28-3 举例说明了一个含有从一个 cDNA 表达文库中表达和纯化获得的 96 个拟南芥蛋白质的芯片 [33]，蛋白质以 4 X 4 模式，在两个相同的区域，水平方向上重复点样，所有的重组蛋白发出一个信号，显示蛋白质表达和纯化效率，同时也说明被转移到芯片上的样品量足以用来检测芯片上的被测重组蛋白质（ 图 28-3)。
3.3 蛋白芯片上的抗体筛选
1. FAST 点样片基上的单克隆抗体筛选
( 1 ) 植物蛋白质芯片在室温下用 2% 的 BSA/TBST 封闭处理 1 h。
( 2 ) 将小鼠抗 RGS-His6 ( 1 : 2000 稀释）或植物特异抗体（如大鼠抗 TCP1 抗体；1 : 1000 稀释）稀释在封闭液中（见注释 11)。
( 3 ) 用 TBST 冲洗 2 次，每次 10 min。
( 4 ) 将芯片片基与相应的 Cy3 标记的第二抗体（兔抗小鼠 IgG 配抗 RGS-His6 —抗；兔子抗大鼠 IgG 配抗 TCP1 抗体）室温下孵育 1h，这些二抗以 1:800 的比例稀释在封闭液中（见注释 13 和注释 14)。
( 5 ) 用 TBST 冲洗 3 次，每次 30 min ( 见注释 15)。
( 6 ) 在扫描之前，我们用微孔板离心机甩干芯片（Eppendorf，Hamburg，Germany，产品目录号：5810R ) 或人工吹干。
( 7 ) 用 428Arrayscanner 扫描仪或 ScanArray 4000 扫描仪检测信号。
所有抗体孵育步骤都要在盖板下的 200 μl 孔中进行。
为了排除二抗的非特异结合，我们进行了一组平行实验，即，将蛋白质芯片置于不含一抗的封闭液中孵育接着用相应的二抗进行孵育，包括上述的冲洗步骤。
图 28-4 显示了用单克隆抗 TCP1 抗体孵育一个拟南芥蛋白质芯片后的荧光图像。96 个通过全长 cDNA 表达克隆获得的拟南芥蛋白质吸附在 FAST 点样片基上（4 X 4 点样模式，在两个相同的区域中，水平方向上重复 2 次点样)。这张图显示抗 TCP1 抗体仅特异识别 TCp1 蛋白点，并且不会与其他吸附的拟南芥蛋白质发生交叉反应（ 图 28-4)。
2. FAST 点样片基上的多克隆抗体筛选
( 1 ) FAST 点样片基室温下在鱼胶（10% 溶解在 TBST 中）中封闭处理 1 h。
( 2 ) 将兔血清稀释在封闭液中（如抗 DOF11 的稀释比例为 1 : 1000，抗 MYB6 血清的稀释比例为 1 : 500 ) ，然后室温下，用其孵育芯片点样片基 1 h。
( 3 ) 用 TBST 冲洗 2 次，每次 10 min。
( 4 ) 点样片基在室温下用羊抗兔子 IgG-Cy3 配体继续孵育 1 h，配体以 1 : 800 的比例稀释在封闭液中（见注释 13)。
( 5 ) 用 TBST 冲洗 3 次，每次 30 min。
( 6 ) 在扫描之前，我们用微孔板离心机甩干芯片（Eppendorf，Hamburg，Germany，产品目录号：5810 R ) 或人工吹干。
( 7 ) 用 428Arrayscanner 扫描仪或 ScanArray 4000 扫描仪检测信号。所有抗体孵育步骤都要在盖板下的 200 μl 孔中进行。
3.4 图像分析
点的平均强度数据（扣除背景）可通过 GenePixPro 4.0 获得；如果要做进一步的比较，强度平均值可通过计算重复的点获得。
我们用在 PQE30 表达载体里构建的，可表达带 N 端 RGS-His6 标记的大肠杆菌 cDNA 表达克隆来生产重组植物蛋白。由于超出本章节的范围，我们不在此详细叙述这种表达克隆的产生过程，只是简要地概括一下。从下列的 cDNA 表达库中，我们也许能获得以上所述的植物表达克隆：在表达载体 PQE30NST ( 检索号：AF074376 ) 中构建的大麦表达库和在 pQE30NAST attB 载体（检索号：AF386205 ) 中构建的拟南芥表达库。这些表达库已经按照 Konrad Buessow 研究小组的方法，用脱氧胸腺嘧啶脱氧寡核苷酸作引物，生产具有完整 N 端的重组蛋白 [ 34~36] 。我们用全长拟南芥克隆作为植物蛋白表达克隆的另一个来源，这个全长拟南芥克隆是通过用基因特异引物限制性依赖克隆，或用 GATEWAY 克隆技术重组依赖性克隆，进行可读框直接克隆获得的。
为了从上述这些资源中高通量和小规模表达植物蛋白质，我们采用如下方法。
蛋白质表达
( 1 ) 在孔体积为 2 ml 的 96 孔深孔板上加满附加了 2% 葡萄糖，100 μg/ml 氨苄青霉素和 15 μg/ml 卡那霉素的 100 μl 2YT 培养基。
( 2 ) 重组克隆培养物从之前保存在 -80°C 的 384 或 96 孔微孔板上接种出来，接种时要用 96 针复制器。
( 3 ) 培养物在 37°C 剧烈振摇（320 r/min ) 生长 16 h 后，加入 900 μl 预先加热的培养基（1X SB 培养基，附加了 100 μg/ml 氨苄青霉素，15 μg/ml 卡那霉素，20 μg/ml 硫胺的 1X PP 缓冲液），然后继续培养 2 h。
( 4 ) 为了诱导蛋白质表达，加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，并继续培养 4~5 h。
( 5 ) 4°C，1500 g 离心 10 min，收集细胞，沉淀物于 -80°C 下保存。
( 6 ) 取出一部分收获细胞的裂解产物在 15% 的聚丙烯酰胺凝胶上检测蛋白质表达效率（图 28-1)。
蛋白质纯化
( 1 ) 首先，在解冻的沉淀物中加入 150 μl 的变性裂解缓冲液，剧烈涡旋振荡溶解沉淀物，然后室温下振摇（约 650 r/min) 孵育 30 min ( 见注释2) 。
( 2 ) 1900 g 离心裂解细胞。上清液转移到 96 孔滤板上（见注释 3 )，并且用真空抽滤盒（vacuummanifold) 迅速吸入到一新鲜滤板上（见注释 4 和注释 5) 。
( 3 ) 接着在每个孔中加入 30 μl NiNTA-琼脂糖（1 : 2 稀释于裂解液中），用胶带密封，室温下，300 r/min 振摇 1 h，使组氨酸标记物与蛋白质结合。
( 4 ) 用 100 μl 的洗涤缓冲液重悬、洗涤琼脂糖微球，振摇 5 min，重复 3 次，然后将上清液转移到真空歧管中（见注释 5) 。
( 5 ) 最后，用 80 μl 的洗脱液静止孵育琼脂糖微球 20 min，将蛋白质从琼脂糖微球中洗脱出来，洗脱液过滤转移到一个新鲜的 96 孔板上（见注释 6)。
( 6 ) 蛋白质在 4°C 下保存。
( 7 ) 纯化的蛋白质可被分离，如用 15% 的聚丙烯酰胺凝胶（图 28-2)。蛋白浓度用 Bradford 蛋白质分析方法确定。
运用上述方法，我们获得了平均浓度约为 100 μg/ml 的纯化蛋白质（数据未显示）。
3.2 构建植物蛋白质芯片
我们将 FAST 点样片基用作构建植物蛋白质芯片的表面，进行抗体分析或蛋白磷酸化研究 ( 见第 29 章 ) 。
( 1 ) 在构建芯片之前，先将 20 μl 的纯化植物蛋白和对照（见注释 8 ) 转移到 384 孔板上。
( 2 ) FAST 芯片片基放在 QArmy 芯片检测系统上，此芯片检测系统带湿度控制器 ( 65%~70% ) 和 16 个顶端直径为 150 μm 的钝头不镑钢，针距为 4.5 mm。我们采用 120 μm 的点深度。
( 3 ) 每个样品上样一次，每个点上样量为 0.6 nL。
( 4 ) 每一次点样后，点样器要用双蒸水清洗（6 s )，热风机吹干（2 s ) ，再用 80% 的乙醇清洗（6 s ) ，再次吹干，防止交叉污染。
( 5 ) 蛋白质芯片在密闭的片基盒中，4°C 保存。
蛋白质可以不同的模板形式点样，如 4 X 4 、8 X 8 、10 X 10 等（见注释 9) 。同样， 蛋白质也可以重复点样，如 2 次 ，4 次或多次等。研究抗体和抗原之间的相互作用，建议在两个相同的区域在水平方向上点样 2 次（见注释 10)。
用这个方法构建的植物蛋白质芯片可用来进行抗体分析研究，在 4°C 保存时至少能在 3 星期内提供可重复的结果。此外，这种植物蛋白质芯片还可用于蛋白激酶磷酸化的研究 [ 8，33] ，本书中已有详细的介绍（见第 29 章 ) 。
为了检测固定在蛋白质芯片片基上的重组植物蛋白，按照如下方法（见 28.3.3 节 1 ) 将芯片片基孵育在抗 RGS-His6 的抗体中。图 28-3 举例说明了一个含有从一个 cDNA 表达文库中表达和纯化获得的 96 个拟南芥蛋白质的芯片 [33]，蛋白质以 4 X 4 模式，在两个相同的区域，水平方向上重复点样，所有的重组蛋白发出一个信号，显示蛋白质表达和纯化效率，同时也说明被转移到芯片上的样品量足以用来检测芯片上的被测重组蛋白质（ 图 28-3)。
3.3 蛋白芯片上的抗体筛选
1. FAST 点样片基上的单克隆抗体筛选
( 1 ) 植物蛋白质芯片在室温下用 2% 的 BSA/TBST 封闭处理 1 h。
( 2 ) 将小鼠抗 RGS-His6 ( 1 : 2000 稀释）或植物特异抗体（如大鼠抗 TCP1 抗体；1 : 1000 稀释）稀释在封闭液中（见注释 11)。
( 3 ) 用 TBST 冲洗 2 次，每次 10 min。
( 4 ) 将芯片片基与相应的 Cy3 标记的第二抗体（兔抗小鼠 IgG 配抗 RGS-His6 —抗；兔子抗大鼠 IgG 配抗 TCP1 抗体）室温下孵育 1h，这些二抗以 1:800 的比例稀释在封闭液中（见注释 13 和注释 14)。
( 5 ) 用 TBST 冲洗 3 次，每次 30 min ( 见注释 15)。
( 6 ) 在扫描之前，我们用微孔板离心机甩干芯片（Eppendorf，Hamburg，Germany，产品目录号：5810R ) 或人工吹干。
( 7 ) 用 428Arrayscanner 扫描仪或 ScanArray 4000 扫描仪检测信号。
所有抗体孵育步骤都要在盖板下的 200 μl 孔中进行。
为了排除二抗的非特异结合，我们进行了一组平行实验，即，将蛋白质芯片置于不含一抗的封闭液中孵育接着用相应的二抗进行孵育，包括上述的冲洗步骤。
图 28-4 显示了用单克隆抗 TCP1 抗体孵育一个拟南芥蛋白质芯片后的荧光图像。96 个通过全长 cDNA 表达克隆获得的拟南芥蛋白质吸附在 FAST 点样片基上（4 X 4 点样模式，在两个相同的区域中，水平方向上重复 2 次点样)。这张图显示抗 TCP1 抗体仅特异识别 TCp1 蛋白点，并且不会与其他吸附的拟南芥蛋白质发生交叉反应（ 图 28-4)。
2. FAST 点样片基上的多克隆抗体筛选
( 1 ) FAST 点样片基室温下在鱼胶（10% 溶解在 TBST 中）中封闭处理 1 h。
( 2 ) 将兔血清稀释在封闭液中（如抗 DOF11 的稀释比例为 1 : 1000，抗 MYB6 血清的稀释比例为 1 : 500 ) ，然后室温下，用其孵育芯片点样片基 1 h。
( 3 ) 用 TBST 冲洗 2 次，每次 10 min。
( 4 ) 点样片基在室温下用羊抗兔子 IgG-Cy3 配体继续孵育 1 h，配体以 1 : 800 的比例稀释在封闭液中（见注释 13)。
( 5 ) 用 TBST 冲洗 3 次，每次 30 min。
( 6 ) 在扫描之前，我们用微孔板离心机甩干芯片（Eppendorf，Hamburg，Germany，产品目录号：5810 R ) 或人工吹干。
( 7 ) 用 428Arrayscanner 扫描仪或 ScanArray 4000 扫描仪检测信号。所有抗体孵育步骤都要在盖板下的 200 μl 孔中进行。
3.4 图像分析
点的平均强度数据（扣除背景）可通过 GenePixPro 4.0 获得；如果要做进一步的比较，强度平均值可通过计算重复的点获得。
来源：丁香实验
