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科研学霸天团，48小时有问必答

问热蛋白组学TPP/CETSA方法，在提取细胞裂解物的时候，为什么用的是冻融法，而不是用表面活性剂

loveliufudan

这是因为在热蛋白组学实验中，使用表面活性剂（如Triton X-100）会破坏细胞膜，导致蛋白质的热稳定性发生改变，进而影响实验结果的准确性。此外，表面活性剂还可能影响到蛋白质与小分子药物的相互作用。相比之下，冻融法可以在不破坏细胞膜的情况下释放细胞内的蛋白质，并且有助于保持蛋白质的天然构象。因此，冻融法在热蛋白组学TPP/CETSA方法中被广泛采用。

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问ELISA实验标准曲线相关

juyue2010

个别出现偏差，可能是加样的问题，去掉即可。或重新检测

4 回答45 围观

问硫酸铵沉淀蛋白是加配制好相应饱和度的溶液还是直接直接加固体

loveliufudan

如果你想沉淀蛋白质，你需要先配制好相应饱和度的硫酸铵溶液，然后慢慢加入到蛋白质溶液中，并不断搅拌均匀。直接加固体硫酸铵可能会导致局部过饱和或者不均匀，影响沉淀效果。

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问wb实验同样的操作条件和试剂，蛋白条带完全不一样，一个非常清晰一个几乎无条带，是一抗不行了吗？

balalaLy

抗体孵育时间，还有TBST的ph值也是会有影响的

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问western转膜之后，封闭之前要不要洗膜？还是转完之后直接放在封闭液里？

juyue2010

需要用PBST清洗一下，洗掉转膜缓冲液

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问DCA曲线问题

asswei

决策曲线分析是一种评估和比较合并临床结果的预测模型的方法，只需要对模型进行测试的数据集，并将其应用于具有连续或二分类结果的模型。因此，从该图形来看，难以做出合理的结论。

3 回答83 围观

问紧急求助四环素诱导系统

loveliufudan

四环素诱导系统一般使用四环素或其衍生物，如强力霉素（Dox）作为诱导剂。脱水四环素盐酸盐也是一种四环素类似物，可以用于诱导基因表达。但是，不同的四环素类似物对tTA或rtTA的亲和力不同，可能影响诱导效果。此外，还要注意细胞培养血清中是否含有四环素或其衍生物，以免干扰系统的调控。

3 回答157 围观

问丙酮固定细胞会掉怎么办

loveliufudan

使用丙酮固定细胞时，需要注意固定时间和温度。固定时间太短或温度太低，可能会导致细胞未被充分固定而易于脱落。此外，使用PBS或者其他缓冲液洗涤细胞时，也需要轻轻摇晃孔板，避免过于强烈的震动导致细胞脱落。除了固定时间和温度，另外一些可能导致细胞易于脱落的因素包括：细胞密度过低或过高，都可能导致细胞易于脱落。转染试剂或细胞培养液的质量问题，可能会导致细胞易于脱落。细胞黏附能力较差或对特定基质无法黏附，也

4 回答57 围观

问求助WB 大分子条带消失的原因？

huarenqiang5

主要考虑以下几点原因：1）胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应；2）蛋白质降解；3）上样量过多或过少及样品弥散。

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问请教，STAT3和p-STAT3 Western Blot蛋白检测

毛利小五郎的徒弟

提取总蛋白检测p-STAT3会产生干扰，导致结果不准

3 回答576 围观

问求助289kDa蛋白转膜条件及分离胶浓度

huarenqiang5

289KDa蛋白转膜建议用 4%的浓缩胶，6％的分离胶，湿转140v恒压3h。

3 回答74 围观

问有没有人用DIA-NN搜库的时候一直出现无法识别raw文件的情况啊

毛利小五郎的徒弟

可以下载一个修复的附件，就可以识别了

3 回答54 围观

问wb结果为什么背景比较黑且条带不清晰？

huarenqiang5

考虑以下几点原因： 1.膜污染 2.曝光时膜上发光液不足 3.封闭时间不够 4.封闭液不合适 5.TBST被污染 6.洗涤不彻底 7.抗体浓度可能过高 8.抗体和封闭剂之间的交叉反应建议按以下几点处理： 1.使用干净的镊子并戴上手套操作，以防止膜污染。 2.使膜充分浸在发光液中 3.增加封闭孵育时间 4.换其他封闭液(5%脱脂奶粉、5%BSA) 5.使用新的TBST 6.增加洗涤时间和

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问ERK、JNK WB条带趋势

huarenqiang5

想要验证对MAPK信号通路的影响，建议做磷酸化的WB比较好。

3 回答329 围观

问有没有做过cell free表达蛋白的大神！

asswei

无细胞技术（cell-free）蛋白质表达上的应用，作为近年来单独列出的蛋白表达系统，主要用于表达膜蛋白等难以在细胞内获取的蛋白。膜蛋白在细胞间联系、表面识别、细胞骨架接触、信号传导、酶活性及物质运输中扮演了重要角色。由于其具有多种细胞功能，膜蛋白是非常理想的药物靶标。但是，膜蛋白的其复杂的优化过程使得纯化非常困难并且耗费时间。无细胞技术可以用来来获得高得率的可溶性的膜蛋白。在无细胞技术无细胞技

3 回答91 围观

问血小板测蛋白可以直接冻吗

毛利小五郎的徒弟

短时间可以，时间长蛋白质会变性所以不建议。

5 回答90 围观

问western blot 相关实验

huarenqiang5

考虑以下几点原因：①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量，也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整，如Enlight-plus。②. 蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。③. 抗体效价不高，用量不足，孵育时间太短，或抗体反复使用保存不当而失活。可考虑更

5 回答138 围观

问COIP实验中INPUT无目的蛋白，pulldown中能砸到目的蛋白，why？

huarenqiang5

主要考虑以下几点：（1）样品中目的蛋白未表达或者表达量低。这种情况下建议确定目的蛋白的蛋白谱，确定它会表达。（2）可以适当增加裂解液，但要注意后续要将裂解液去除干净。（3）抗体使用量少，没有足够的抗体去捕获目的蛋白。建议增加抗体的使用量。（4）缓冲液、洗脱液的pH可能不能将目的蛋白洗脱。建议根据想要洗脱的蛋白质，调整溶液正确的二pH值。（5）抗体没有与免疫吸附磁珠结合。注意查看磁珠与抗体亚型是否

4 回答51 围观

问请教一下各位老师关于ROC曲线位于参考线以下的问题

汤姆卜丽波

Roc就是该指标下的生存面积，原数据才是最准确的改动了后面的数据都对不上了

3 回答109 围观

问HL-60和NB4细胞诱导分化问题

汤姆卜丽波

你可以做个梯度预实验按比例添加ATRA，找到合适的比例再大规模诱导

4 回答87 围观

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