羊抗鼠血清制备

抗血清的制备程序

免疫原的配制

1、福氏不完全佐剂（ Ferund ' S adjuvant , imcomplete , FIA )100克石腊油与50克羊毛脂置于盐水瓶中充分涡旋混匀，过滤除菌或高压灭菌（10P15分钟），置4℃存放备用。（有市售产品， Sigma )

2、福氏完全佐剂（ Ferund ' S adjuvant , compelete , FCA ）取干粉卡介苗25-250mg

于100ml盐水瓶中草药，加10ml福氏不完全佐剂，于涡旋器上混匀30-60分钟，再加40ml福氏不完全佐剂再混匀10-20分钟，4℃存放备用。（有市售产品， Sigma )

3、免疫原的配制

取等体积的蛋白质溶液与福氏完全佐剂或不完全佐剂分别置于二支洁净灭菌 管中，用2-5ml注射器（配5号针头）吸取约1/5V的抗原溶液，将针头插入佐剂液面下，急速注入油层。置旋涡器上充分混合。用同样的方法分4-5次将其余的抗原溶液与佐剂混合。再于涡旋器混匀30分钟，然后再用注射器反复抽吸，配成油包水"颗粒"，静置15分钟后，观察管底部有无水相析出，如有水相析出，则再用注射器将水相注入油层，并混合之。

制成的油包水乳剂在免疫动物之前需检查其乳化效果，方法是：取一只烧杯装满水，滴数滴上述乳剂于水面，第一滴通常分散开而其他滴呈球状。如也分散开则表明不是油包水乳剂。

3、一些抗原，如全菌抗原、颗粒抗原等，可以不使用佐剂而直接免疫动物。

每只山羊背部皮内多点注射6mlFCA- Ag （每点30-50ul，共含蛋白质量600ug)。

2、1个月后，颈部和后腿部肌肉注射4mlFIA- Ag （蛋白质量用400ug).

二周后试血，若效价达不到，同2继续加强免疫，直至效价达1:32以上。

采血，-20℃保存。

1.一般在第三次免疫后7～10天即可于小鼠尾尖取少量血，分离出血清之后进行试血。

环状试验，较为经典的方法，目前较少采用，如与20μg/ml以下的抗原于30 min内能出现的沉淀环，即测定抗体效价达1：5000以上时为合格。

2.放血

经效价检查合格后即可放血。放血前动物应停食12 h，以减少血清中的脂肪含量。如拟保留该免疫动物，可直接由心脏取血，或切开耳缘静脉滴血或心脏穿刺取血。取血后由静脉缓缓注入等量5%葡萄溶液以补足失血量。取血的动物经2～3个月休息，可再次加强免疫后取血。

3.分离血清

必须在无菌条件下进行，待收集于平皿或三角瓶内的血液凝固之后，用无菌滴管在无菌环境（例如超净工作台）中把血kuai与瓶壁剥离后，放入37℃，1～2h取出后放入4℃过夜，使血清充分析出（不能冰冻，否则产生溶血），经离心沉淀分出血清，放进低温冰箱保存。使用前必须经过签定合格后再分装保存备用。

4.抗血清的保存

1）经签定合格后的抗血清，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其zui后浓度分别为0.01%或0.05%。

2）用无菌滴管将抗血清分装小管，每管装1ml左右。

3）-20℃以下保存，可保存2年以上。

4）如有条件可将血清冷冻干燥保存于4℃以下，保存时间更久

s11、取羊抗鼠血清2体积份,分别加入pbs缓冲液1.8-2.2体积份和饱和硫酸铵溶液0.8-1.2体积份,充分混匀;

s12、11000-13000r/min离心18-22min,弃沉淀,除去纤维蛋白;

s13、上清中加入饱和硫酸铵溶液2.8-3.2体积份,充分混匀;