（共享） 高免血清制备的方案！！

见到有不少人还在为高免血清的制备而烦恼，想到自己以前查资料时的窘态，正好自己做过这方面的实验，现在拿出来大家分享一下，我的是用猪的细小病毒对兔子进行攻毒，而的高免血清，不同的抗原和实验动物其方案也不同，但是总体步骤应该差不多，我这也是做为一个参考，请高人指教其中可以改进的地方，我将不胜感激：

PPV的纯化，高免血清的制备及抗原IgG的提取方案

1 实验动物与方法

1.1实验动物

豚鼠(体重500克左右) 家兔体重约2—2.5kg

1.2方法

1.2.1 高纯度PPV抗原的制备即PPV细胞液的纯化、浓缩取PPV细胞培养物，反复冻融3次，4℃, 8000r/min，离心30min，取上清，向上清液中缓慢加入NaCI和PEG-6000至终浓度0. 5mo1/L和10%，搅拌均匀，用lmol/LNaOH调pH至8.0,4℃冰箱过夜。

10000r/min离心30min，弃上清，用0.05mol/L,pH7.6Tris-HC1缓冲液3倍量稀释沉淀，抽提3次，3次上清液合并，19500r/min离30min,取上清，加入少许双抗，-20℃保存备用。用0.5%豚鼠红细胞在4℃下测定血凝价，并采用Lowry法检测病毒蛋白含量.

1.2.2.兔抗PPV高免疫血清的制备

1.2.2.1 动物免疫

采用背部皮下多点注射对2只家兔进行免疫，每次的剂量递增，所用抗原均为浓缩PPV抗原，免疫程序及免疫方法见下表：

PPV抗血清制备的免疫程序和方法

免疫 动物数量（只） 抗原剂量 途径

次序 时间

首免 2 背部皮下多点注射
二免 一周后 2 背部皮下多点注射
三免 两周后 2 背部皮下多点注射
四免 两周后 2 背部皮下多点注射
五免 约十天后 2 背部皮下多点注射

1.2.2.2 血清中抗体效价的检测和抗血清采集

分别于三免、四免、五免后8天试血，用琼扩试验检测抗体效价，待抗体效价达到较高水平时，从家兔耳静脉大量采血，按常规的方法分离、收集血清。

1.2.2.3 兔抗PPV IgG的提取

1.2.2.3.1 50%饱和硫酸铵盐析

取20ml高免血清加等量pH7.4, O.Olmol/LPBS缓冲液，在缓慢搅拌下滴加饱和硫酸铵溶液40m1. 4℃静置60min, 4℃, 10000r加in离心1Omin，弃去上清液。

1.2.2.3.2 33.3%饱和硫酸铵盐析

取上述沉淀，溶于PBS使成20ml，如上法滴加饱和硫酸铵,溶液10m1,4℃静置60min,4℃,1000Or/min离心10min，弃去上清液。如此重复两次，使沉淀勿达到完全白色为止，最后将沉淀溶于少量PBS.

1.2.2.3.3 G-50凝胶过柱

按常规方法将G-50凝胶溶胀、漂洗处理后，装柱、平衡过夜，将盐析提取IgG慢慢加入柱中，用0.01 mol/L pH7.4PBS缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，用20%磺基水扬酸测试，出现蛋白(白色沉淀)开始定量收集，直至无蛋白为止，每管约5-7ml，然后按顺序于280nm波长下测试吸光值。

1.2.2.3.4 IgG透析纯化

1.2.2.3.4.1 透析袋处理

先用50%乙醇慢慢煮沸Ih，再分别用54%乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠溶液、O.OOlmol/L EDTA溶液依次洗涤，最后用蒸馏水漂洗数次。

1.2.2.3.4.2 透析

将通过G-50凝胶过柱收集的蛋白峰的洗脱液合并，装人处理好的透析袋中，于40C.PBS中透析(PBS用量至少为透析物体积的50倍)，每隔2h换液一次，第三次换液后4℃过夜。

1.2.2.3.5 IgG的浓缩

将透析好IgG溶液包埋于蔗糖粉中4℃进行浓缩，体积缩小至原体积1/10，再用。.22微米滤膜过滤除菌，-20℃保存，并用751型紫外分光度计检测其在260nm和280nm处的吸光度值，计算蛋白含量。

蛋白含量(mg/ml)=(1.45XOD280nm-0.74XOD260nm)X稀释倍数