方案2 细胞/组织的制备实验

分离出来的移植物需要进一步制备，制备的方法有如下三种：分离后含有残存的组织块或聚集物的细胞悬液；单细胞悬液；完整的组织块。

完整的组织块常用于外科手术补洞的移植实验，如 Stenevi 等（1985) 所做的那样。此外，Soteb 和他的同事曾经把小脑原基的组织块植入小脑发育缺陷的小鼠脑内（Sotelo and Alvarado Malkrt 1987)。实验者应用整块组织的原因可能是在已知确切分化方向的情况下，希望保留移植物相对完整的结构。也有使用碎裂但没有完全分散的组织的先例（Bjorklimd and Dunnett 1992)。

本章重点讲述使用细胞悬液的方法。应用细胞悬液的一大优点就是可以将细胞悬液通过精确定位注射到靶点，例如，应用汉密尔顿注射器（Hamiltonsyringe) 或玻璃毛细管均可达到大脑深部位点（Bjdrklundetal.1980,1983)。应用细胞悬液还可以对注入各个部位的细胞数量及其生存能力做出直接的评估（Brundin et al.1985a;Nikkhah et al.1994a;Barker et al.1995)。

上述三种方式之中哪一种最好，要根据具体实验所要求的细胞种类、移植存活率和治疗效. 果具体而定下面给出的实验方法是作者实验室在工作中证明可行的。当然，随着工作的进一步开展，这些实验方法可能需要不断的修正。

一、制备细胞悬液

为了得到细胞悬液，组织块通常需要经过机械分离和酶的消化。这个过程会影响到细胞的生存能力和移植的成功率，所以要尽可能地优化这一过程（Barkeretal.1995)。

例如，将胚胎多巴胺能神经元植入成体脑中时，只有 5%~20% 的细胞存活率（SauerandBrundin1991)，如果在分离过程中应用脂质过氧化反应的抑制剂，如拉扎碱类 (Iazaroids), 可以提尚植入细胞的存活率（Nakaoetal.1994)。最近，研究发现天冬氨酸特异的半腕氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific protease,caspase) 的抑制剂可以使移植到偏侧帕金森病大鼠模型脑内的多巴胺能神经元减少凋亡，提高其存活率 (Schierleetal.1999)。对于酶消化的过程来讲，Bjorklund 等（1986) 证实在制备来自蓝斑的去甲肾上腺素能神经元的过程中，只有不使用胰蛋白酶才能得到较好的移植存活率。此外，Olsson 等（1997) 发现将未经胰蛋白酶处理（即保持细胞表面分子完整）的神经节隆起细胞植入大鼠胚胎侧脑室，可产生更多的特异’性同源整和。除了优化制备细胞悬液的过程之外，实验者现在开始尝试在移植前，用营养因子和选择性培养方法体外扩增中脑前体细胞的数量（Studeretal.1998)。

1.如上文所述分离得到胚胎组织，然后将组织块收集在盛有分离用培养基的 Eppendorf 管或小瓶中。

2.组织块在含有 0.1% 胰蛋白酶和 0.5%DNA 酶（deoxyribonuclease,DNase，Sigma) 的培养基中 371：赌育 20 min。

3.组织块用培养基小心地洗 4 次，以除去胰酶。

4.培养基的终体积用一个均值来衡量，如 10^1/块组织。向试管中加入含有 DNA 酶的培养基，根据需要的细胞悬液的浓度来确定加入的总体积，一般说来，分离下来的腹侧中脑应加培养基 5~6M1/块，每个神经节突起（LGE+MGE) 大约 5M1。

5.用巴斯德吸液管反复吹打组织块，使之在机械作用下形成乳状的细胞悬液。一般选择两种不同直径的吸液管。小心不要产生气泡。这样得到的细胞悬液中既含有单细胞也含有聚合物以及组织的小碎块。应避免吸管过度吹打，一般 10~15 次即可以达到较好的分离效果而不会对细胞造成过度的伤害（Bjorklund and Dunnett1992)。细胞悬液的浓度和生存能力可以用台盼蓝染料排斥法（Trypan blue dye exclusion method) 判断，或用吖陡橙（acridineorange) 或溴化乙陡（ethidiumbromide) 染色。用血细胞计数板完成细胞计数（BmndinetaL1985a)。

二、单细胞悬液

为了达到显微移植技术的要求，使注入的细胞悬液体积更少，应使用直径更小的玻璃毛细管移植细胞。因此，实验者对传统的制备细胞悬液的技术进行了改良（Nikkhahetal.1994a,b)。利用这种技术可以得到均匀的单细胞悬液，从而达到了精确估计悬液中细胞密度的目的，保证了移植细胞数量的可重复性。Nikkhah 等（1994a，b) 曾利用这一手段进行腹侧中脑移植，下面的实验方法就是基于这一实验。

1.组织块收集，胰蛋白酶消化，以及去除胰酶的方法，与制备细胞悬液时一样。

组织块与培养基的体积要适合吹打分离（250ul 或 500ul)，具体根据组织块的量来定。

2.组织块先用 1 mlEppendorf 移液器反复吹打，机械分离形成乳状细胞悬液。再用 200^1Eppendorf 移液器反复吹打形成均匀的单细胞悬液。之后，用血细胞计数板测量悬液细胞的浓度，在总体积已知的情况下，计算可知总细胞数。

3.600r/min 离心 5 min。

4.沉淀用 200ul Eppendorf 移液器在事先准备好的终体积培养基中重新吹打形成悬液。培养基的体积决定于细胞的总数及所需要的适当终浓度。例如，Nikkhah 等用 10(^1 培养基和 25 块腹侧中脑组织制成了终浓度每微升 100 000~150 000个细胞的悬液。

三、细胞的生存能力和保存

通过台盼蓝染料排斥法或吖啶橙/溴化乙啶染色，血细胞计数板进行细胞计数后，实验者发现新制备的细胞悬液有非常好的生存能力，如腹侧中脑组织的细胞悬液中有 90%~95% 的活细胞。在移植过程中，细胞悬液可以在室温下保存数小时而维持其生存能力，但随着时间的延长，生存能力会降低，这也与组织的种类和供体胎龄有关 (BmndinetaL1985a)。在大多数实验中，我们在移植过程中将细胞悬液放在冰上或冰箱里保存。

为了长期保存组织，可以在移植前促使组织冬眠，如腹侧中脑或神经节隆起可以保持数天（Sauer and Brundin 1991;Frodl et aL 1995;Grasbon-Frodletal.1996;Nikkhah et al.1995)。同样，在液氮中冻存也是可行的，但会显著降低移植后的存活率和功能。