方案1 胚胎中枢神经组织的分离实验

CNS 移植物对供者年龄有一定要求，只有来自胚胎/胎儿或新生供者的移植物才能在分离后直接移植成功。一般认为，移植的最佳时期是在神经元进行最后的细胞分裂而没有形成广泛的轴突投射之前（Bj6rklundandStenevi1984)。..

一、啮齿类动物的孕程

1.最好选择知道确切交配时间（阴栓阳性的日期）的孕鼠。在交配成功之后的第一个清晨，检查雌鼠，可在阴道处发现黄白色阴栓，将这一天定义为胚胎 0 天 (embryonicday0，E0) 〇胎龄还可以通过其与顶臀长 (crown-to-rumplength,CRL; 表 14-1) 的关系推知，把胚胎放在载玻片上以毫米为单位测量顶臀长。通过练习，可以通过触诊孕鼠（用乙醚轻微麻醉）测量胚胎的大致年龄。对于大鼠来讲，E13 前后的胚胎呈清楚的球状，其直径与顶臀长相近（DunnettandBj6rklund1992)。E18 以后的大鼠胚胎被称为胎鼠.

2.胚胎组织的最适年龄视具体实验要求而定。下面介绍了不同脑区适宜移植的胎龄。不同品系的啮齿类动物的孕期会有所差异，但大鼠一般为 21~22d, 小鼠一般为 19~20d。除非特别指明，本章给出的实验方法主要是针对大鼠的。读者如果想了解小鼠大脑中相应脑区适宜移植的发育时期，请査阅相关的文献 S:Alvarez-Bolado 和 Swanson(1996) 总结出了一条规律：在妊娠第一周，大鼠的发育比小鼠晚 1-1.5d, 在第二周晚 2d, 在第三周晚 3-4d。

二、获取胚胎和中枢神经组织

1.经过深度麻醉，供者腹部去毛并以 70% 乙醇消毒，用消过毒的器械开腹，用另一套消过毒的剪刀和慑子取出子宫角，放在盛有培养基的消毒小管中。之后，处死供者 (过量给药或断头)。用小剪刀和小镊子把胚胎从子宫角中一个一个地分离出来，放进盛有培养基的已消毒带盖培养皿（petridish) 中。

2.胚胎可以在肉眼下，用显微剪或锋利的解剖刀片从近尾段断头（除非需要分禽脊髓的某一特殊部位)。这样，脑与上段脊髓分离出来。将头移入一个新的培养皿并置于解剖显微镜下，用两把眼科镊撕去脑外包绕的其他组织，如皮肤、肌肉、头骨\脑膜。在剥离过程中，注意不要伤及脑组织。可以在头骨上做一正中切口，以便于剥去发育中的软骨。

3.将脑组织移入盛有新鲜培养基的培养皿以备进一步做特定脑区的分离。在这一步操作中，应多次用培养基冲洗脑块，以去掉残血和组织碎片。

三、胚胎/胎鼠 CNS 分离

以下介绍了一些最常用脑区的分离方式，图 14-2 为这些脑区在发育中啮齿类动物脑内的定位。

如果希望进一步了解情况，读者可以查阅啮齿类动物 CNS 发育相关的详细图谱和文献（AltmanandBayer1995;BayerandAltman1995;Alvarez-BoladoandSwanson1996)。下面的实验方法由本章作者选自相关文献。由于各个脑区发育特征不同，在具体实验过程中应对移植物分离的具体细节做出相应调整，以求完善实验过程。选择不同的发育时间点，在分离所得移植物中会有不同的细胞类型及不同的前体细胞、成熟细胞和分化细胞比例。不同脑区分离方法可参考 Seiger(1985) 和 Dunnett 等（1992,1997) 的文章。

对于任何分离手术来讲，均须注意下列事项：

1.脑组织必须用镊子小心轻取，镊子捏取的部位应尽量远离目的脑区，不要直接捏挤目的脑区本身，目的脑区要用锋利的显微解剖剪剪下。

2.在向小管或小皿中转移小块移植物时，不能直接用镊子夹起，应用剪刀或弯头镊子从下方托起，以保证组织块处于适中的表面张力下。

3.在分离过程中，组织块在分离用培养基中可置于室温下保存。

四、神经节隆起

神经节隆起（ganglioniceminence) 位于前脑脑泡（telencephalicvesicle) 底部（图 14-3)，发育形成纹状体（corpusstriatum), 包括纹状体（striatum) 或尾状核（caudateputamen) 和苍白球（pallidum)(SmartandSturrock1979)。大鼠尾状核神经发生始于 E12，终止于出生后第 3 天，在 E15 达到高峰（Bayer1984;MarchandandLajoie1986)。外侧神经节突起（lateralganglioniceminence,LGE) 和内侧神经节突起（medialganglioniceminences,MGE) 在移植实验中已被广泛应用，尤其是在亨廷顿病的动物模型实验中（Wictorin1992;Bj6rklundetal.1994)。近来，研究者开始注意这两个隆起与纹状体和其他相关脑区的不同关系。实验表明，LGE 是形成纹状体神经元的主要区域，可以形成投射神经元和一部分共表达 GABA 和生长素抑制因子（somatostatin) 的纹状体中间神经元（Olssonetal.1998b)。MGE 主要形成苍白球和前脑基底部的神经元以及纹状体的胆碱能中间神经元（Olssonetal.1998b)。由于这些研究成果的出现，针对神经节隆起有了多种不同的分离方法。根据不同实验所需的区域或细胞种类，可选择 LGE 单独分离或 LGE 和 MGE 同时分离。具体的分离方法同样受胎龄影响，在大鼠最常用的是 E12'15, 在小鼠常用 Ell~14。关于分离神经节隆起的详细情况可在 Olsson 等（1995) 的文章中査到。下面的实验方法可以用于同时分离 LGE 和 MGE 或单独分离其中的一种结构（图 14-3 为 E14~15 大鼠 LGE 和 MGE 同时分离的示意图)。

1.大脑腹面向下放置，沿端脑泡皮质的中脊纵向切开，皮质层向两侧打开以暴露下面的神经节隆起。

2.欲同时获取 LGE 和 MGE, 可依图 14-3 所示，从尾状核角部切下一块心形组织。如果只取 LGE 或 MGE, 先在两个隆起间做一切口，然后水平分离获取所需部位。如水平切口较浅，则主要获得生发细胞；如果切口较深，也可获得分化细胞。

五、隔区

在大鼠胚胎隔区和斜带核（diagonalbandnuclei) 的发育过程中，胆减能细胞产生于 E12-16(SembaandFibiger1988), 这些区域已经用于痴呆或衰老模型的移植治疗。有报道说，使用 EW-15 分离的胚胎隔区可获得较高的存活率和较好的治疗效果 (Nilssonetal.1988)。如图 14-4 所示，隔区可以用两种方法分离，即常规方法可以同时获得隔区和对角带（diagonalband) 的可变区；用特异的方法分离只得到隔区（Dunnettetal.1986;Nilssonetal.1988;Dunnett and Bjorklund1992)。

1.常规方法（图 14-4A~C): 大脑背面向下放置，由腹侧面做两个冠状切口，一个在未发育的嗅球后（图 14-4B-1), 另一个在下丘脑嘴侧（图 14-4B-3)。之后，在神经节隆起或纹状隆起（striataleminence) 内侧做双侧矢状切口（图 14-4B 和图 14-4C-2), 最后，由背侧分开隔区和皮质原基（corticalanlage)(图 14-405)。

2.特异方法（图 14-4D~F): 在前脑于嗅球和下丘脑之间做冠状切片，图 14-4D 为侧面观，E 为腹侧面观，之后，可以从冠状切片腹内侧部分离出隔区，在去掉覆盖着的纹状隆起之后，可以由切片腹外侧部获得发育中的基底核（nucleusbasalisofmeynert,NBM)。

六、腹侧中脑

实验者常由胚胎的腹侧中脑（ventralmesencephalon,VM) 分离获取发育中的多巴胺目神经兀，用于帕金森病动物模型的治疗（Brundinetal.1994)。在大鼠，腹侧中脑的多巴胺能神经兀产生于 E13~15(BayerandAltman1995), 这一阶段的供体组织较利于移植。腹侧中脑的分离方法如图 14-5 所示，进一步的细节与参考资料见 Dunnett 等（1997) 的文章。

1.胚胎腹侧面向上放置，分别在中脑与间脑交界处和中脑曲尾部做冠状切口，可以分离得到双侧腹侧中脑。具体操作方法如下：先在中脑曲嘴侧做冠状切口（图 14_5A-1)，之后在中脑尾侧做冠状切口（图 M-5A-2)。冠状切口的位置也可以依照覆盖其上的丘胎 I(thalamus) 及顶盖（tectum) 表面的标志来定位，如图 14-5D 辅助线所示。最后，如图 14-5C 所示，在图 14-5A-3 和图 14-5B-4 处做两个矢状切口，获得组织块。

2.在去掉脑膜时应特别小心，可先完成解剖分离，然后在解剖显微镜下通过提起间叶细胞层去掉脑膜。
CNS 移植物对供者年龄有一定要求，只有来自胚胎/胎儿或新生供者的移植物才能在分离后直接移植成功。一般认为，移植的最佳时期是在神经元进行最后的细胞分裂而没有形成广泛的轴突投射之前（Bj6rklundandStenevi1984)。..

七、海马

在局部缺血等疾病模型中，海马（hippocampus) 组织有广泛的移植应用（T6nderetal.1989;Hodgesetal.1994)。在胚胎发育过程中，海马神经元形成相对较晚，在出生后齿状回仍能产生很多颗粒细胞（BayerandAltman1995)。最近发现，成年啮齿类动物齿状会终生保持形成神经元的能力（Gageetal.1998)。为了获取含有丰富锥形神经兀的移植物，可以选择 E18 的大鼠或出生后仍处于发育期的动物（SundeandZimmer1983)。在后一时间点分离可以获得海马结构中某一特定区域的细胞。图 14-6 为 E18 大鼠胚胎海马原基的解剖图。

为了到达海马层，由皮质原基中线旁开一贯穿全长的辅助纵向切口（图 14-6A)，在尾端，这一切口恰好沿着海马原基的侧面。向两侧拉开发育中的皮质（图 14-6B)，切断扣带回（cingulatecortex) 和海马伞（fimbria), 轻轻向后推海马组织，使之与下面的丘脑脱离（图 14-6C), 最后，切断海马下端的连接，去掉脑膜和新皮质（图 14-6D)。

八、新皮质

将皮质原基完整地沿纵向剥下，即获得完整的烦顶部新皮质（neocortex)。新皮质常用于新生鼠或成年鼠皮质梗死等疾病模型的移植实验，参见 Castro 等（1988)、Grabowski 等（1992) 和 Kdb 等（1994) 的文章。新皮质发育相对较晚，据报道，较好的移植时机为妊娠中期或出生后数天内。

1.首先，沿端脑泡中线纵向切开整个新皮质，向两侧打开新皮质。在嘴侧和尾侧各做一冠状切口，并沿着神经节隆起纵向切开，就获得了整块组织。可以再按照具体某个脑区的要求确定组织块的大小和保留脑区。

2.在取组织块之前或之后撕下脑膜均可。

九、其他区域

发育中 CNS 的其他区域也可以作为移植实验的供体组织，例如，脊髓（Bregman1994), 小脑原基（SoteloandAlvaradoMallart1987)，视网膜（LundetaL1987)，下丘脑（WoodandCharlton1994)，蓝斑（Bjtirklundetal.1986) 和背侧中缝核（Fosteretal.1988)。具体分离方法见 Seiger(1984) 和 Dunnett 等（1992) 的文章。