方案3 成体移植实验

本节重点讲述向成年受者脑实质中注射细胞悬液的方法，其他文献中有关于脑室移植（Freed1985) 和把组织块植入脑内移植用空腔的报道（Stenev1etal.1985)。

一、麻醉和常规手术操作

1.大鼠根据当地实验室方法麻醉。

2.大鼠置于立体定位仪上，使移植物得以精确定位，并可反复放置。

3.动物深度麻醉后，剃去头上的毛，用 70% 乙醇擦拭皮肤。用解剖刀片纵向切开头部皮肤，去掉颅骨表面的肌肉和结缔组织。

4.以前囟（bregma) 或后囟（lambda) 为基准点进行测量。文献中报道过许多损毁模型和不同移植位点的相关资料，包括立体定位的坐标和移植相关的各种特定参数, 如纹状体（Brundin et al.1985a)、黑质（Nikkhah et al.1994b)、海马（Bengzon et al.1990)、丘脑（Peschanski and Isacson1988)。在设计实验的过程中，建议读者在综述中査找相关数据，如 Bj6rklund 和 Dunnett 等（1994) 的文章。新的立体定位坐标也会在大鼠的脑片图谱中给出，如 Paxinos 等（1986,1997),Swanson(1992) 的文章, 小鼠的相关参数见 Franklin 和 Paxinos(1997) 的文献。

5.确定坐标后，用牙钻在颅骨上打出小孔，但应保持脑膜完整。

二、注射器械

可选择一个精密的微量进样器，如 2/nl 或 IOfJHamilton 注射器（HamiltonBonaduz,Switzerland) 向移植位点注射细胞。细胞可以由一个内径适合细胞悬液通过的金属套管 (不锈钢针）直接注入脑内。为了缩小注射器尖端的直径以减少组织损伤及注射后细胞悬液的回流，Nikkhah 等（1994a) 做了一个外径为 50~7(Vm 的精密玻璃毛细管，套在注射器的针尖上，这个套管如图 14-7 所示。用一个标准的吸液管拉制器，把一个玻璃毛细管（内径 0.55 mm; 外径 1.0 mm) 拉成一个长径吸液管或毛细管，用一截聚乙烯套管（内径 0.58 mm; 夕卜径 0.965 mm) 做接头，连接注射器的金属套管（外径0.5 mm) 和玻璃毛细管，聚乙烯套管先用吹风机的热风轻微加热，然后拉成圆锥形封套，直径小的一头可以紧密地固定在金属套管上，再把玻璃毛细管和聚乙烯封套连接在一起 (Nikkhah et al.1994a)。

玻璃毛细管的最佳内径取决于所注射的悬液种类（Nikkhah et al.1994a)。对于均匀的单细胞悬液来讲，可以用直径很小的毛细管；含有聚集物或密度较高的细胞悬液要求毛细管的直径略粗，以避免阻塞；当注射完整的组织块时，要使用较大的注射器。

三、注射细胞

1.在移植过程中，我们通常把细胞悬液放在冰上或冰箱里，在使用前，如果发现有沉淀物，可以用吸液器轻柔吹打使之重新混悬。

2.抽吸充满注射器的针头或玻璃毛细管。使用连有玻璃毛细管的 Hamilton 注射器时，先移走针栓，向注射器和毛细管内注满培养基。注意不要在注射器或毛细管内形成气泡，要检查毛细管与聚乙烯套管连接的地方是否渗漏。使用玻璃毛细管的另一个好处就是在实际注射过程中，可以在显微镜下观察通过毛细管的细胞。

3.大部分实验中的垂直坐标是由脑膜表面开始计算的（图 14-8)。以 lyl/min 的速度注射细胞悬液，注射中间以极短暂的停顿，注射完毕之后，停针 2 min，缓慢拔出注射器。

4.缝皮或使用回形针闭合伤口。

四、关于免嗖抑制剂的使用

一般认为 CNS 是免疫豁免区，这表示脑内的异体移植与体内其他部位相比有更高的存活率（Widner and Brundin1988;Sloan et al.1990;Widner1995)。移植后免疫反应的影响因素有许多，如供体和受者之间的差异程度 （同种异体 dgeneic)，即在同种动物的不同品系之间进行移植；同源性异种移植（concordant xenogeneic)，即种属较接近的供体和受者之间进行移植；非同源性异种移植（discordant xenogeneic), 即在种属差异较大的供体和受者之间进行移植]、脉管系统的来源、抗原呈递细胞的含量以及局部的免疫抑制因子等。在脑内，异体移植的存活率同样由供体的组织制备和移植位点决定。同种异体组织的细胞悬液及少数异种组织，在植入纹状体后有较高的存活率；但是，同样的移植物植入海马，或向脑室内移植组织块，则需要使用免疫抑制剂，否则会发生较强的免疫排斥反应（Widner1995)。

本章引用的大量研究所使用的是同源移植（syngeneicgraft)(在同品系的供体和受体之间进行移植)，一般不需要免疫抑制剂。将小鼠的组织植入大鼠体内，环孢菌素 A(cyclosporinA) 可以提高移植细胞的存活率（Brundinetal.1985b)。在作者的实验室，移植后给受者腹腔注射环抱菌素 A10 mg/kg(Sandimmun;Sandoz，Basel,Switzerland), 环孢菌素 A 溶解在聚乙二醇（cremophor) 和生理盐水中，终浓度为 10 mg/ml。在给予免疫抑制剂的前 10 天，需在动物的饮用水中添加抗生素（如 Borgal，Hoechst,Munich，Germany)。Pakzaban 和 Isacson(1994) 对神经系统异种移植后全身使用免疫抑制剂的效果做了分析，发现使用免疫抑制剂可以全面提高存活率至大约 75%, 而不使用免疫抑制剂其存活率则会降低到 30%。Pedersen 等（1995) 认为多种免疫抑制剂（环孢菌素 A、硝基咪哇、泼尼松龙）联合应用非常有效。

有效的免疫抑制方法有多种，但都不能减少并发症和费用。除了每天腹腔注射环孢菌素 A 外，还有几种单独用药的方法，也可以在 1 0~15 周内保持存活率而不会引起损伤，如每天注射甲基泼尼松龙（methylprednisolone)30 mg/kg(Duanetal.1996;Czechetal.1999)。最近推荐单独用药的改良方案为：每天口服泼尼松龙 20 mg/kg 或腹腔注射甲基泼尼松龙 lOmg/kg, 持续 2 周。小鼠受者最好使用抗淋巴细胞血清（anti-lym?phocytesera,ALS) 或单克隆抗体（monoclonalantibodies), 因为常规用药需要给很大的剂量（环孢菌素 A50~80 mg/kg), 毒性较大。抗体治疗通常容易耐受，可以腹腔给药，但需要每 3~5d 重复 1 次，并在移植前几天就开始给药。这种方法可能导致移植耐受（Woodetal.1996)。啮齿类动物的抗体治疗一般比较贵。

对任何移植来讲，如果受者是新生动物，可以自发地忽略移植物，形成免疫耐受 (Brent1990)。将小鼠视网膜植入新生大鼠脑内（LundandBanerjee1992)，可以存活 2 年之久；而同样的组织在成体受者脑中会很快被排斥。受体大鼠的年龄在 8-12d 之即，可以保证移植物存活而不受排斥（LundandBanerjee1992)。在作者的实验中，通常将小鼠细胞移植到出生后 1?2d 的大鼠脑内，获得了较好的效果。

五、组织进一步处理和灌注的注意事项

在一些移植实验中，移植物可以在活体中检测其功能，如用微透析测量递质释放 (Campbelletal.1993)，行为测试（Dunnett1994) 或应用不同的脑成像方法 (Frickeretal.1997)。对于组织化学分析来讲，动物要先处死，然后根据后续分析方法的需要用特殊的方法做进一步的处理。为了进行详细的解剖学研究，动物在处死前通常会注射神经解剖示踪剂。分析移植物的方法还包括免疫细胞化学方法和原位杂交。现代组织学方法详见第十五章。

就作者实验室常规使用的免疫组织化学分析来讲，动物用大剂量戊巴比妥深度麻醉。之后通过心脏灌流固定大脑。在灌流时，先用生理盐水或磷酸盐缓冲液（phos_phatfrbufferedsaline,PBS) 做短暂的冲洗（Imin), 之后用 4% 多聚甲醛 (paraformaldehyde, 溶于 PB)250~300 ml 固定，根据接下来的分析需要后固定数小时或过夜。当脑块在 20% 蔗糖缓冲溶液中沉底后，用冰冻显微切片机切开，备用。