组织和细胞RNA的制备:TRIzol法
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TRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCO BRL公司推出专供提取RNA的产品,其操作方便、快捷。
(一)试剂准备
1. TRIzol试剂。
2. 氯仿
3. 异丙醇
4. 75%乙醇(DEPC H2O配制)
5. DEPC H2O
(二)操作步骤
1. 样品处理:
(1)培养细胞:收获细胞1-5×107,移入1.5ml离心管中,加入1ml Trizol,混匀,室温静置5min。
(2)组织:取50-100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml离心管中,加入1ml Trizol充分匀浆,室温静置5min。
2. 加入0.2ml氯仿,振荡15s,静置2min。
3. 4℃离心,12000g×15min,取上清。
4. 加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min.
5. 4℃离心,12000g×10min,弃上清。
6. 加入1ml 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4℃,7500g×5min,弃上清。
7. 晾干,加入适量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)。
(三)注意事项
1. 样品量和Trizol的加入量一定要按步骤(1)的比例,不能随意增加样品量或减少Trizol量,否则会使内源性RNase的抑制不完全,导致RNA降解。
2. 实验过程必须严格防止RNsae的污染。