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科研学霸天团,48小时有问必答
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请问裂解细胞进行检测,最少多少动物量就可以完整检测一次
月亮先生
我用七八万的目的细胞群,也能做出荧光定量的实验。就是出峰可能晚了一点
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问
PCR 时如果不同组加的 cDNA的总量不一样有影响吗?
phhcrab
管家(内参)基因必须做啊,不然发文章没戏
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问
在 NCBI 查询到人类的 CD209 有好多条 mRNA 该如何选取?
dengchch
有好多条mRNA是因为这个基因有不止一个转录本,一般情况下是选择最长的转录本进行克隆,当然如果别人有报道说不同的转录本有不同的功能的话最好还是都克隆并研究一下。基因的编码区和启动子序列在NCBI网站上都能查到,你搜索时用gene这个选项卡,然后搜你的基因,在结果中选人的该基因,然后分别去找相关信息。其中编码区就是CDS。设计引物时,如果你要克隆基因,那肯定引物要在CDS区两端,因为你要扩的是完整的
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问
异常PCR条带该怎么处理?
我是金博士
不知道你的目的条带是多大?PCR出现问题是很正常的,一般的解决办法是:(1)摸索PCR条件,优化模板浓度,温度梯度等;(2)重新设计引物。
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问
Western与RT-PCR的区别?
tao0129
这只是从不同的角度来分析,Western研究的是蛋白表达水平,RT研究的是转录水平,尽管二者都是研究基因表达的。但有一定差别,转录水平不完全等同于蛋白表达,因为它没有考虑到转录后调节的问题。但RT有一个好处,只有有序列就可以做,不象Western必须有抗体。并且RT可以研究同一基因不同亚型的表达,而同一蛋白亚型通常有多种基因型。选择哪一种须根据你的目的而言,能两种都做当然好,但有时候也会出现不相一
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问
p 一段 579bp 的基因,p 了 n 次都没成功是为什么?
benjimmy33108
如果就是第二个碱基一个有多态性,那么一般不会有多大影响的,建议你换一个聚合酶试一试,我P过很基因,有些基因就是有一些酶怎么设置都P不出来,结果其他几种可能就能P出来,或者你可以拿最普通的2X预混的先摸一下退货温度之后,看看能否P出来,再进行高保真的PCR.
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问
粪便DNA做荧光定量PCR是否一定需要标准菌株?
helen_gu
做16s吗?可能引物设计比较困难,一般特异性不够,可能会扩出其他的菌
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问
在 DNA 的退火过程中,不小心把温度搞到 45℃(要求55℃)了,怎么办?
elite_xy
毫无影响,希望你不是说退火温度设定到了45℃
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问
针对EV71的VP1的特异记忆性B细胞,对记忆B细胞进行单个细胞RT-PCR,如何设计引物呢?
yuandingli
你如何获得单个B细胞的?如果是血液来源的B细胞,还要筛选吧?如果是融合的细胞,用恒定区的引物就行了。
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问
荧光定量 PCR 的退火温度怎么设定?怎样摸索?
dxy_ivfir56
请问做退火温度梯度pcr是用引物跑普通pcr还是跑荧光定量pcr
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问
实时定量PCR探针法和染色法的区别
常安iron
探针是特异性的,染色法是非特异性的
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问
做转化后菌P时直接挑取单菌落进行PCR,有哪位大侠做成功了?
我是金博士
你是有啥问题吗?转化挑取单菌落PCR,菌落不要太多,其余就按常规PCR流程。一次性多P个几管,分别从不同的平板上挑。
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问
IFN-γ 的 PCR 均不能扩出片段是为什么?
wangweishi_1986
如果引物设计的没问题的话,两个建议:1.降落PCR,2.先将引物对99℃10s,再放冰上,再加到PCR体系里,试一试
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问
实验室对于抑癌基因 p53 突变的检测手段都有哪些啊?
我是金博士
检测突变最直接的是测序,蛋白表达水平下降,影响因素很多,并不能证明p53基因突变。
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问
cDNA 产量的很低是什么原因啊?该怎么办?
tao0129
可能的原因:1.RNA模板质量低。2.对mRNA浓度估计过高。3. 反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足。4.同位素磷32过期。5.反应体积过大,不应超过50 μl。
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问
某一孔荧光信号特别强是怎么回事?
tao0129
原因:1. 试剂配制时反应液没完全溶化,导致探针量在一管中增多。2.试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。3.也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染,这时就要清除热槽中的污染。
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问
有那位高手跑过小鼠 IL-9 的定量 PCR,最近我在跑换了三个引物但仍然没跑出来该怎么办?
葫芦一笑
优化一下引物的温度或者条件, 还有设计的引物要在保守区域
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问
阳性克隆检测PCR问题
过客一名
要不用M13引物或你的引物A或D去测个序,看看究竟连接的片段是什么?
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问
请问大家:我扩增的时候出现两个峰,是不是引物的问题?
我是金博士
不一定,也有可能是引物设计的不好,可以提高下退火温度再看看
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问
RT-PCR 没有产物是为什么?
我是金博士
可能原因:1)RNA被降解建议解决方法:在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA;在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA;如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8 mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。2)RNA中包含逆转录抑制剂建议解决方法:通过乙醇
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