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科研学霸天团,48小时有问必答
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pcr时模版DNA浓度一般是多少最合适呢?
Tl32
pcr技术原理上面说过 ,30到100ng都行
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问
pcr实验对样本有哪些需求呢,薄片上的组织可以做吗?
天一湖医者
样本采集后若无法马上检验需存放于4°C冷藏。需根据病情采集合适的样本。样本若需运送时一律以冷藏或包含冰块/冰袋的
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问
pcr阴性对照有条带,目的基因无条带
天一湖医者
这种情况,升高退火至65度,甚至在68度做两步法PCR,或者是将循环数降低,阴性对照可能就没有扩增了。不过这样灵敏度会降低很多,应该不符合lz检测的初衷,建议更换靶基因。
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问
qPCR的结果中,三个复孔的CT值为何相差巨大
天一湖医者
加模板时是否将头伸至液面以下,保证模板加到反应液中如果上面都没有问题那就是pcr仪器的问题了,可能孔间温度差过大
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问
qPCR实验结果96孔的在多久之内加完样是对结果无大影响的?封膜封到什么程度为最好
天一湖医者
qPCR实验结果96孔的在15min之内加完样是对结果无大影响.
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问
以片段为模板pcr扩增,杂带很多原因
bamboopiggy
是否可以把你的2k的片段做TA克隆,整到载体上,然后再以质粒为模板进行pcr,或者把你重叠延伸得到的2k片段,纯化后再pcr。
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问
实时荧光定量qpcr
bamboopiggy
你要用内壁光滑的ep管啊,那个在逆转录过程中不会软化的,如果软化了,保证哪个地方不对了,不能用了。
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问
real time 实时荧光定量PCR
bamboopiggy
用可以加384孔板的电动移液的排枪,且在加样前设计好加样的位置,可以用于384孔板上样的白枪尖,每个枪尖对应孔板的一个位置。
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问
Qpcr实验中遇到的问题
bamboopiggy
把variation太大的孔删除掉,不能用。加样尽量用好一点的枪和枪尖,同一个样品,可以用同一个枪尖加。
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问
Pcr后跑出来的有杂带的可能原因?
bamboopiggy
引物设计不特异,annealing temperature过低,模板不纯。
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问
哪些原因会导致产物的品质降低?
bamboopiggy
酶的特异性和有效性,模板的纯度,pcr反应液配制过程是不是都是在冰上,pcr仪是否好用。
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问
如果对RT产物进行电泳,理论上电泳图会是什么样的呢?
汤姆卜丽波
应该是和普通pcr差不多的图,可能片段会大一些
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问
荧光定量pcr染料法、探针法应该如何选择?
汤姆卜丽波
各有利弊,探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性,只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号,探针法能够用多重体系反应,能够预测和提前进行反应条件的优化,缺点是要合成探针,成本高.染料法经济实惠,可以做溶解曲线,分析全部PCR产物的TM值,缺点就是特异性没有探针法好
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问
荧光定量pcr与普通pcr用的材料差不多,只是多了染料,是这样么?
汤姆卜丽波
在试剂添加上确实是这样,但是其他方面有本质上的区别,原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光。反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段。如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通pcr必须电泳。结果:荧光定
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问
如何提高荧光定量PCR实验反应的灵敏度与特异性?
bamboopiggy
这个主要取决于你rna提取的质量和你设计的引物的特异性。只要这两个要点把握住了,realtime的结果就不会差。
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问
什么方法可以降低引物二聚体?
balalaLy
降低引物浓度减少循环次数减少模板用量
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问
逆转录形成的c DNA可以振荡离心吗?
汤姆卜丽波
可以涡旋震荡,使样品集中于管底
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问
为什么CT值与起始模板拷贝数成线性关系?
balalaLy
起始模板数越高达到阈值的需要的循环数就越低,根据两者的关系可以建立一条线性方程
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问
内标法和外标法哪种数据更精密?
汤姆卜丽波
如果应用外标法能够满足要求的话,当然首选还是外标法,毕竟简单而省事。对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条件下,用内标法还是必要的。
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问
sybr Green、Taqman、Molecularbeacon、LUX这些方法如何选择?
Eason老歌迷
还是根据你实验室的条件,和你自己的个人习惯进行选择。我们比较喜欢用sybr green,便宜好用
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