以片段为模板pcr扩增，杂带很多原因

是否可以把你的2k的片段做TA克隆，整到载体上，然后再以质粒为模板进行pcr，或者把你重叠延伸得到的2k片段，纯化后再pcr。

是不是这个片段本身不纯，建议将片段跑胶回收纯化后在扩增

退火温度不合适或者体系成分浓度不合适可能会导致条带弥散。不过我有看到资料说pcr循环次数过多和模板含有酒精也有可能导致这样

扩增产物出现多条带(杂带)的原因很多，除外引物原因还有：

1) 循环的次数过多。

适当增加模板的量，减少循环次数。

2) 酶的用量偏高或酶的质量不好。

应降低酶量或调换另一来源的酶。

3) 退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。

应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

4) 样品处理不当。

5) Mg2+浓度偏高。

因适当调整Mg2+使用浓度。

6) 若为PCR试剂盒。

也可能时试剂盒本身质量有问题。

7) 复制提前终止。

使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

8) 反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。

确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

9) 模板量过多。

质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。

10) 外源DNA污染。

确保操作的洁净。

1.引物用量偏大,引物的特异性不高。 应调换引物或降低引物的使用量。

2.循环的次数过多。 适当增加模板的量,减少循环次数。

3.酶的用量偏高或酶的质量不好。 应降低酶量或调换另一来源的酶。

4.退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。 应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。