overlap pcr 如何设计引物？有何注意事项？

重叠延伸pcr的引物设计:引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配），为突变点，突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。然后分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。该步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR 产物末端加A，会造成产物移码突变。其余标准和普通pcr一致的

前一段的正向和后一段的反向，每一段至少要有15个bp的overlap，注意一下退火温度不能相差太大

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过5℃。

3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为72℃左右。

4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰，且 3’端的碱基一般不用A；引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

6、尽量在基因的编码区（CDS序列）上设计引物，限制基因组DNA扩增。

7、使用BLAST检索，确认引物特异性。

应该有如下注意事项：1.两段DNA片段Overlap的部分应该不少于15个碱基；2.鉴于您扩增的片段比较长，应该考虑用扩增长片段的DNA聚合酶3.如果片段GC含量过高，应加入GC Buffer；4.不用先不加两端引物跑10个循环，再加入引物跑20个循环。可以直接加入两段片段和上下游引物进行30-35个循环的PCR；5.两段片段的量不应加入过高，如果是第一轮PCR产物的话，应稀释50倍然后各取1 ?l当作模板；如果是纯化后的产物，加入的量在1-10 ng左右为宜；6.采取上述手段仍无产物，可能是PCR的退火温度不适宜。建议通过梯度PCR摸索条件。