怎么设计重叠延伸PCR(点突变）的引物？
阿荷荷儿
现需要将ARR6DNA序列中编码氨基酸D（天冬氨酸，GAT）的基因突变为编码氨基酸N（天冬酰胺，AAT）的基因，即G变为T的点突变。将重叠延伸PCR得到点突变以后的序列后，需要用质粒pRTL2构建表达载体，因此设计引物时要考虑加入酶切位点。
ARR6的基因如下图所示：需要点突变的DNA位置已经在图中用红色标出
下图是表达载体质粒pRTL2的图谱：
下图是连接载体质粒的图谱：
要求设计两对引物（15-30bp）在突变点后至少有14对碱基，Tm在55-72度之间，引物之间Tm相差小于3度，G/C值40%-60%，deltaG绝对值小于3。请问大神设计引物的流程，是分别设计三次PCR的引物吗？还是每次PCR都要单独考虑？
3 个回答
sswei
多位点突变的话，推荐用back to back的引物设计思路，就是引物刚好不重叠，突变位点在引物的5'末端，这种设计方法好处是因为不存在引物二聚。
阿荷荷儿
这个实验是单个位点突变，5’端有重叠部分，另外想问下如何验证引物的可行性？包括插入的酶切位点能不能使用？
Keven轩
需要根据你想获得的突变片段序列来进行设计，一般长度不要太长，否则两端可能无法配对
loveliufudan
可以遵循以下流程：
1. 确定突变点：根据ARRG基因序列，确定编码氨基酸D（天冬氨酸）的基因突变位置，即G变为T的点突变。
2. 分析突变点周围的序列：确定突变点后至少14对碱基的序列，以便设计引物。
3. 引物设计：根据以下要求设计两对引物：
• 引物长度：15-30个碱基。
• 引物间隔：突变点后至少14对碱基。
• 引物Tm：引物的熔解温度（Tm）应在55-72度之间。
• 引物Tm差异：两对引物的Tm差异应小于3度。
• G/C含量：引物的G/C含量应在40%-60%之间。
• ΔG值：引物的自由能变化（ΔG）绝对值应小于3。
4. 酶切位点添加：考虑在引物的5’端添加适当的酶切位点，以便后续构建表达载体时进行克隆操作。
在引物设计时，可以同时考虑两对引物，以满足设计要求。确保引物之间的Tm差异较小，以避免扩增效率的差异。
需要注意的是，每次PCR都要单独考虑引物设计，因为不同的PCR扩增条件（例如模板浓度、引物浓度、PCR缓冲液等）可能会对引物的设计和性能产生影响。
