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简介
来源:丁香实验
操作方法
1. 以引物 a/b 进行 PCR1。2. 以引物 c/d 进行 PCR2。3. 引物 b/c 中引入了需要的限制性位点。4. 混合二者 PCR 产物,混合以前最好回收一下。5. 进行 PCR 延伸反应,只有右面这个可以延伸。6. 以延伸反应的产物为模板,以 a/d 为引物进行 PCR。7. 产物即为所需最终产物。
🔥 重叠延伸 PCR1)先用灭菌水将模板质粒浓度稀释为 50 ng/µL,各引物浓度稀释为 10 µM 并瞬离置于冰上备用;2)分别用各自的引物对两个基因进行第一轮 PCR 扩增,产物进行柱回收,得到 A' 和 B' 中间片段,PCR 扩增条件为 95 ℃ 预变性 30 s,95 ℃ 变性 15 s,60 ℃ 退火 30 s,72 ℃ 延伸 1.5 min,共 35 个循环,72 ℃ 最后延伸 5 min。3)第二轮
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