重叠延伸 PCR

1. 以引物a/b进行pcr1。 2. 以引物c/d进行pcr2。 3. 引物b/c中引入了需要的限制性位点。 4. 混合二者pcr产物，混合以前最好回收一下。 5. 进行pcr延伸反应，只有右面这个可以延伸。 6. 以延伸反应的产物为模板，以a/d为引物进行pcr。 7. 产物即为所需最终产物。

1）先用灭菌水将模板质粒浓度稀释为 50 ng/µL，各引物浓度稀释为 10 µM 并瞬离置于冰上备用；2）分别用各自的引物对两个基因进行第一轮 PCR 扩增，产物进行柱回收，得到 A' 和 B' 中间片段，PCR 扩增条件为 95 ℃ 预变性 30 s，95 ℃ 变性 15 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1.5 min，共 35 个循环，72 ℃ 最后延伸 5 min。3）第二轮