【求助】重叠延伸PCR技术扩增长片段

请问各位高手，我需要将1000多和2000多的两个片段连接起来，用重叠延伸PCR技术的方法怎么也连接不起来？（重叠碱基23个）总是扩增出1000多的杂带，没3000多的目的片段，原因可能是什么？希望大家给予指点！谢谢！

你做extension overlap PCR的多么？

不妨将完整的实验方法列上来，包括每步PCR的步骤和回收的步骤、方法~

23bp我觉得确实还是有些勉强，尤其你的片段长，如果能排除别的问题，增加几个碱基更好啊

首先，把1000多和2000多的两个片段变性后（如果能分离出单链，可能效果更好），不加两端引物进行PCR

然后，再加1000多的上游引物和2000多的下游引物进行PCR（第一次那产物可能不需要太多，杂质多了PCR影响大。由于PCR指数扩增，模板量少在这里不是问题）

当然，你用的所有试剂要有保证，比如要高保真的要扩增效率高的酶，一般的Taq酶work不了的...

另外，重叠区23bp的Tm与退火温度要相应调整，如果能加长一点可能更好...

每一个具体的实验，可能具体参数会有不同...

Good Luck！

在做重叠延伸PCR时，要注意一个关键的问题，如果你用Taq酶话，会在扩增产物的3‘端多一个A尾，如果你其他条件都没问题的话，就要考虑一下是不是这个A尾影响了碱基配对的问题，可以换用平末端酶（如pfu酶）一试。祝实验顺利！