PCR 扩増实验
最新修订时间:
材料与仪器
dNTP混合物 基因特异的正向引物 基因特异的反向引物 单链cDNA TaqDNA聚合酶 RT-PCR缓冲液
PCR仪 PCR管
PCR仪 PCR管
步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
去除 RNA 酶的双蒸水
10XRT-PCR 缓冲液(100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶缓冲液
TaqDNA 聚合酶(5U/ul)
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP 混合物(10 mmol/L,包含所有四种 dNTP)
基因特异的正向引物(5umol/L)
基因特异的反向引物(5umol/L)
单链 cDNA(见第一部分)
4. 放射性复合物
[a-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37 GBq)
5. 实验器材
薄壁的 PCR 管
6. 专用仪器
可编程的 PCR 仪
二、方法
1. 准备 PCR 反应混合物。
由第一部分制得的 cDNA 11ul
10XRT-PCR 缓冲液 55ul
10 mmol/LdNTP 混合物 44ul
5umol/L 基因特异的正向引物 22ul
5umol/L 基因特异的反向引物 22ul
5U/ulTaqDNA 聚合酶 2.75ul
去除 RNA 酶的双蒸水 387.75ul
[a-32P]dCTP(10uCi/ul) 5.5ul
2. 平均 50ulPCR 反应混合物分别放入 10 个薄壁 PCR 管中。
3. 带有热盖的适当的 PCR 仪(如:GeneAmpPCRSystem9700,AppliedBioSystems)
上运行 PCR。PCR 扩增的循环参数如下。
94°C30s
退火温度 30s
72°C30s
35 个循环
4. 每次奇数脉冲循环后放在冰上取样,由第 15 个循环起始,到第 35 个循环终止。
5. 变性聚丙烯酰胺凝肢(6% 丙烯酰胺/8mol/L 尿素)上分析样品。每个样品上样
10ul。滤纸上干燥凝肢,用 Phosphorlmager 或 X 射线片和 densitometer 对产物定量,也可以将产物条带从凝胶上切下,通过闪烁记数仪定量。
6. 信号的对数(y 轴)对应循环数(x 轴)作图。选择处于线性范围中心的循环数在后
续实验中使用。
1. 缓冲液、溶液和试剂
去除 RNA 酶的双蒸水
10XRT-PCR 缓冲液(100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)
2. 酶和酶缓冲液
TaqDNA 聚合酶(5U/ul)
3. 核酸和寡核苷酸
dNTP 混合物(10 mmol/L,包含所有四种 dNTP)
基因特异的正向引物(5umol/L)
基因特异的反向引物(5umol/L)
单链 cDNA(见第一部分)
4. 放射性复合物
[a-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37 GBq)
5. 实验器材
薄壁的 PCR 管
6. 专用仪器
可编程的 PCR 仪
二、方法
1. 准备 PCR 反应混合物。
由第一部分制得的 cDNA 11ul
10XRT-PCR 缓冲液 55ul
10 mmol/LdNTP 混合物 44ul
5umol/L 基因特异的正向引物 22ul
5umol/L 基因特异的反向引物 22ul
5U/ulTaqDNA 聚合酶 2.75ul
去除 RNA 酶的双蒸水 387.75ul
[a-32P]dCTP(10uCi/ul) 5.5ul
2. 平均 50ulPCR 反应混合物分别放入 10 个薄壁 PCR 管中。
3. 带有热盖的适当的 PCR 仪(如:GeneAmpPCRSystem9700,AppliedBioSystems)
上运行 PCR。PCR 扩增的循环参数如下。
94°C30s
退火温度 30s
72°C30s
35 个循环
4. 每次奇数脉冲循环后放在冰上取样,由第 15 个循环起始,到第 35 个循环终止。
5. 变性聚丙烯酰胺凝肢(6% 丙烯酰胺/8mol/L 尿素)上分析样品。每个样品上样
10ul。滤纸上干燥凝肢,用 Phosphorlmager 或 X 射线片和 densitometer 对产物定量,也可以将产物条带从凝胶上切下,通过闪烁记数仪定量。
6. 信号的对数(y 轴)对应循环数(x 轴)作图。选择处于线性范围中心的循环数在后
续实验中使用。
来源:丁香实验