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PCR 扩増实验

最新修订时间:

材料与仪器

dNTP混合物 基因特异的正向引物 基因特异的反向引物 单链cDNA TaqDNA聚合酶 RT-PCR缓冲液
PCR仪 PCR管

步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

去除 RNA 酶的双蒸水

10XRT-PCR 缓冲液(100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)

2. 酶和酶缓冲液

TaqDNA 聚合酶(5U/ul)

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP 混合物(10 mmol/L,包含所有四种 dNTP)

基因特异的正向引物(5umol/L)

基因特异的反向引物(5umol/L)

单链 cDNA(见第一部分)

4. 放射性复合物

[a-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37 GBq)

5. 实验器材

薄壁的 PCR 管

6. 专用仪器

可编程的 PCR 仪

二、方法

1. 准备 PCR 反应混合物。

由第一部分制得的 cDNA                      11ul

10XRT-PCR 缓冲液                              55ul

10 mmol/LdNTP 混合物                        44ul

5umol/L 基因特异的正向引物               22ul

5umol/L 基因特异的反向引物               22ul

5U/ulTaqDNA 聚合酶                            2.75ul

去除 RNA 酶的双蒸水                           387.75ul

[a-32P]dCTP(10uCi/ul)                         5.5ul

2. 平均 50ulPCR 反应混合物分别放入 10 个薄壁 PCR 管中。

3. 带有热盖的适当的 PCR 仪(如:GeneAmpPCRSystem9700,AppliedBioSystems)

上运行 PCR。PCR 扩增的循环参数如下。

94°C30s

退火温度 30s

72°C30s

35 个循环

4. 每次奇数脉冲循环后放在冰上取样,由第 15 个循环起始,到第 35 个循环终止。

5. 变性聚丙烯酰胺凝肢(6% 丙烯酰胺/8mol/L 尿素)上分析样品。每个样品上样

10ul。滤纸上干燥凝肢,用 Phosphorlmager 或 X 射线片和 densitometer 对产物定量,也可以将产物条带从凝胶上切下,通过闪烁记数仪定量。

6. 信号的对数(y 轴)对应循环数(x 轴)作图。选择处于线性范围中心的循环数在后

续实验中使用。

来源:丁香实验

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