PCR技术（十一）：PCR片段拼接的SOE和SDL方法

PCR技术（多聚酶链式反应）是现代分子生物学的一个巨大突破，它能在体外迅速、 大量、灵敏地扩增基因片段。可是，经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效 拼接，却是一个很值行探讨的问题。

传统的方法是引入限制性内切酶位点，这不但操 作繁杂，而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因 拼接的新方法 ，即SOE和SDL法，就能巧妙地解决这个问题。

SOE法

　　1989年，Horton 等人提出了SOE法（Gene splicing by over lap extension） ，即通 过复制时DNA链的交错延伸不实现基因拼接。本法可分四步进行。

　　（1） 引物设计：引物a和d是常规引物；b的左半段为常规引物，右半段为基因Ⅱ的引 物序列；c同理；则b和c的部分碱基可互补配对。

　　（2） 基因I、Ⅱ分别扩增，产物相应为片段A、B和C、D。

　　（3） 两种产物混合，经变性及退火处理，A链和D链部分碱基互补配对，成杂交链。

　　（4） 在DNApolymeraseI作用下，A和D链互为引物和模板，合成出A'D'链，即为基因I 和基因Ⅱ的接接产物。若在引物中引入突变的碱基序列，则在接接产物中，将按预先 设计要求出现定点突变。

SDL法

　　1991 年下半年，Lebedenko 等人提出SDL方法（Gene splicing by directed liga- tion），即直接拼接法 ，它在SOE法基础上又有新的突破。本法的要点如下：

　　（1） 限制性内切酶，EcoRI核酸内切酶（或其它Ⅱs类限制性内切酶）能专一性识别 6bp的非回文序列，并能单向特异性地切断EcoRI识别的6bp以外的1―5个核苷酸，产 生一个以突出的4个核苷酸为结尾的5'末端。因而该伸头末端与酶切位点序列无关， 而是由切点附近的序列决定的。

　　（2） 扩增时实际运用的引物的构建。以exon5的实用引物为例：5'链引物包括常规5' 链引物序列和BamHI识别位点及起密码序列；3'链引物包括常规3'链引物和AC及EcoRI 识别位点。

　　（3） 唯一性末端的形成。经扩增和限制性内切酶处理后可得供拼接的exon5，它的右 侧突出末端TCAC中，TC为原始exon5的一部分，AC为原始exon6的一部分，且TCAC与 exon6的AGTG互补配对，其余类推。因为这种结尾相同的几率为1/259，故可被视作 “唯一性末端”。

　　（4） 把经扩增的exon5、exon6和exon7混合，依据碱基互补配对原则，它们就能按顺 序依次拼接。

　　显而易见，在SOE法中，退火时的最希望产物是AD，杂交链，但A链和B链，C链和D链 配对的可能性更大，另外还有B、C链的配对，这些都是不利的；而SDL法中就不存在 这个问题。另一方面，由于不需DNApolymeraseI，避免了它在复制中可能带来的错 误，所以，SDL法更优越。

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