IFN-γ 的 PCR 均不能扩出片段是为什么？

嘎嘎1989

2013-05-21

最近师兄让我帮他做 IFN-γ 的 PCR，用正常人 cDNA 和 molt4、jurkat 细胞株均尝试了55°，58°，60°，65°的退火温度，均不能扩出目的片段，只能见到引物二聚体，β2M 能够扩出来，说明体系应该没有为题，引物有introvegene提供。请各位高手指点，排除引物的问题还可怎样进行尝试？IFN-γ的片段大小为 553kb，上游引物：5'- GCTCTAGAGATTTCAACTTCTTTGGCTTA-3' 下游引物：5'-TTGTCGACGCAGGCAGGACAACCATTACT-3'

2 个回答

wangweishi_1986

2013-05-23

有帮助

如果引物设计的没问题的话，两个建议：1.降落PCR，2.先将引物对99℃10s，再放冰上，再加到PCR体系里，试一试

苏格兰白草莓

2013-05-22

有帮助

你的引物片段好长啊，而且你这个是人IFNG的引物么？我用PRIMER 5验证了一下，有些序列和人的IFNG匹配不上啊，你这个引物是自己设计的还是找公司设计的还是文献上给的啊，文献的话IF是多少啊？我把PRIMER 5的结果给你看一下，你这个还不能够拿到BLAST上去验证，因为和IFNG匹配不上，大概看了一下你这个引物还是存在一定问题的。