IFN-γ的诱生和IFN-γ的测定

一、 IFN-γ 的诱生

IFN-γ的诱生剂包括多种有丝分裂原，例如植物血凝素（PHA）、美洲商陆（PWM）、ConA、SPA、葡萄球菌肠毒素A和B（SEA和SEB）以及抗淋巴细胞血清（AIS）和抗人T细胞CD3McAb等。

1．常规方法分离人外周血单个核细胞。

2．用含5％正常人血清（或10％新生小牛血清）、10mmol/LHEPES、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL卡那霉素、pH7.2～7.4的1640液调整细胞浓度为5×10 6 —10×10 6 /mL。

3．加PHA50—100tzg/mL（或PWM5～10ug/mL、ConA10—20itZ/mL，均为终浓度），37℃培养48-72h。

4．2000r/min离心20min，收集上清液，除菌过滤即为IFN-7样本，20℃保存。

二、 IFN-γ 的测定

1．上述测定IFN-γ效价的方法也适用于IFN-β抗病毒活性的测定，但需用IFN-γ标准品作对照，同时检品常按1：2比例稀释。

2．MHC-Ⅱ类抗原诱导法IFN-β是诱导MHC-I类和Ⅱ类抗原表达的主要细胞因子之一，用抗MHC-Ⅱ类抗原的McAb可定量测定IFN-γ活性

（1）用完全培养液配制IFN-γ标准品2．0mL，浓度为1200U/mL（对人和鼠IFN-γ分别为40和120ng/mL），再按1：3系列稀释5个稀释度（取前液0.6mL，加完全培养液1.2mL），培养液种类根据所用细胞决定。

（2）待测样本准备4个稀释度，原浓度和按1：10稀释3个浓度。

（3）用培养液将指示细胞（Colo-205或WEHI-3细胞）配成8×10 5 /mL。

（4）加2.0mL完全培养液，1．0mL指示细胞悬液和1.0mLIFN-β标准品或标本于12孔培养板，设空白对照，常规培养48h。

（5）用橡皮玻棒轻擦每一培养孔，使细胞与孔底分离，用吸管吹吸3次使成单细胞悬液，将细胞转入12×75mm塑料试管，以后步骤无需无菌操作。

（6）1000r/min离心10min，去上清，用3mL洗液重悬细胞，同上离心，去上清。

（7）用含1％正常鼠血清的洗液250mL重悬细胞，4℃孵育30min。

（8）每孔加1001TL 生物 素化抗MHC—Ⅱ抗原的McAb5ug/mL，4℃孵育60min。

（9）用4℃PBS洗细胞3次，然后用4℃预冷的PBS250uL悬浮细胞。

（10）用4℃PBS将链霉亲合素-F1TC稀释5倍，每孔加100uL，4℃孵育30min。

（11）同上洗2次，用500uL4℃PBS悬浮细胞。

（12）用流式细胞仪测细胞荧光，减去背景荧光（即只用链酶亲合素-FITC处理的未刺激细胞的自发荧光），以确定特异性荧光强度。

（13）以荧光强度对IFN-γ标准品浓度作图绘制标准曲线，从标准曲线上读取待测样品的IFN-γ浓度。

3．双抗体夹心、ELISA法在获得抗IFN-~McAb和多克隆抗 血清 时，可用此法测IFN-γ量。

[附]：VSV培养液的制备及稀释度估算。

1．接种Vero细胞于150cm 2 培养瓶 ，用完全DMEM液培养。

2．待细胞形成单层后，倾去上清，每瓶感染2.5×10 5 个蚀斑形成单位（PFU）的VSV（于3mL培养液中），37℃5％C0 2 条件下温育45min，使病毒吸附于细胞。

3．每瓶补充培养液12mL，同上培养24h，当CPE>5％时，收集细胞，500r/min离心10min，去细胞碎片。

4．在冰浴中将各瓶病毒上清混合，分装成每支0.5mL或lmL，-70℃保存（-20℃时病毒易失活）。

5．用蚀斑测定法测定病毒贮存液的PFU／mL，估算用于IFN活性测定时的病毒稀释度。例如，测得VSV贮存液的活性为1×10 9 PFU／mL，MOl为（multiplicityofinfection，即病毒感染细胞比）为0.1，即每10个细胞感染1个病毒，L929细胞的浓度为2×10 5 ／孔，每孔加入的VSV稀释液为100uL，则稀释倍数应为1：5000。