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IFN-γ的诱生和IFN-γ的测定

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一、 IFN-γ 的诱生

IFN-γ的诱生剂包括多种有丝分裂原,例如植物血凝素(PHA)、美洲商陆(PWM)、ConA、SPA、葡萄球菌肠毒素A和B(SEA和SEB)以及抗淋巴细胞血清(AIS)和抗人T细胞CD3McAb等。

1.常规方法分离人外周血单个核细胞。

2.用含5%正常人血清(或10%新生小牛血清)、10mmol/LHEPES、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL卡那霉素、pH7.2~7.4的1640液调整细胞浓度为5×10 6 —10×10 6 /mL。

3.加PHA50—100tzg/mL(或PWM5~10ug/mL、ConA10—20itZ/mL,均为终浓度),37℃培养48-72h。

4.2000r/min离心20min,收集上清液,除菌过滤即为IFN-7样本,20℃保存。

二、 IFN-γ 的测定

1.上述测定IFN-γ效价的方法也适用于IFN-β抗病毒活性的测定,但需用IFN-γ标准品作对照,同时检品常按1:2比例稀释。

2.MHC-Ⅱ类抗原诱导法IFN-β是诱导MHC-I类和Ⅱ类抗原表达的主要细胞因子之一,用抗MHC-Ⅱ类抗原的McAb可定量测定IFN-γ活性

(1)用完全培养液配制IFN-γ标准品2.0mL,浓度为1200U/mL(对人和鼠IFN-γ分别为40和120ng/mL),再按1:3系列稀释5个稀释度(取前液0.6mL,加完全培养液1.2mL),培养液种类根据所用细胞决定。

(2)待测样本准备4个稀释度,原浓度和按1:10稀释3个浓度。

(3)用培养液将指示细胞(Colo-205或WEHI-3细胞)配成8×10 5 /mL。

(4)加2.0mL完全培养液,1.0mL指示细胞悬液和1.0mLIFN-β标准品或标本于12孔培养板,设空白对照,常规培养48h。

(5)用橡皮玻棒轻擦每一培养孔,使细胞与孔底分离,用吸管吹吸3次使成单细胞悬液,将细胞转入12×75mm塑料试管,以后步骤无需无菌操作。

(6)1000r/min离心10min,去上清,用3mL洗液重悬细胞,同上离心,去上清。

(7)用含1%正常鼠血清的洗液250mL重悬细胞,4℃孵育30min。

(8)每孔加1001TL 生物 素化抗MHC—Ⅱ抗原的McAb5ug/mL,4℃孵育60min。

(9)用4℃PBS洗细胞3次,然后用4℃预冷的PBS250uL悬浮细胞。

(10)用4℃PBS将链霉亲合素-F1TC稀释5倍,每孔加100uL,4℃孵育30min。

(11)同上洗2次,用500uL4℃PBS悬浮细胞。

(12)用流式细胞仪测细胞荧光,减去背景荧光(即只用链酶亲合素-FITC处理的未刺激细胞的自发荧光),以确定特异性荧光强度。

(13)以荧光强度对IFN-γ标准品浓度作图绘制标准曲线,从标准曲线上读取待测样品的IFN-γ浓度。

3.双抗体夹心、ELISA法在获得抗IFN-~McAb和多克隆抗 血清 时,可用此法测IFN-γ量。

[附]:VSV培养液的制备及稀释度估算。

1.接种Vero细胞于150cm 2 培养瓶 ,用完全DMEM液培养。

2.待细胞形成单层后,倾去上清,每瓶感染2.5×10 5 个蚀斑形成单位(PFU)的VSV(于3mL培养液中),37℃5%C0 2 条件下温育45min,使病毒吸附于细胞。

3.每瓶补充培养液12mL,同上培养24h,当CPE>5%时,收集细胞,500r/min离心10min,去细胞碎片。

4.在冰浴中将各瓶病毒上清混合,分装成每支0.5mL或lmL,-70℃保存(-20℃时病毒易失活)。

5.用蚀斑测定法测定病毒贮存液的PFU/mL,估算用于IFN活性测定时的病毒稀释度。例如,测得VSV贮存液的活性为1×10 9 PFU/mL,MOl为(multiplicityofinfection,即病毒感染细胞比)为0.1,即每10个细胞感染1个病毒,L929细胞的浓度为2×10 5 /孔,每孔加入的VSV稀释液为100uL,则稀释倍数应为1:5000。

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