紫外线诱变法

紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素，它的主要作用是使 DNA 双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的 DNA 损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理时以及处理后的操作应在红光下进行，并且将照射处理后的微生物放在暗处培养。

1. 菌悬液的制备

1.1 取培养 48 h 生长丰满的枯草芽孢杆菌 BF7658 斜面 4～5 支。用 10 ml 左右的无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入一支无菌大试管中，将试管在振荡混合器上振荡 30 s，以打散菌块。

1.2 将上述菌液离心（3000 r/min，10 min）， 弃去上清液，用无菌生理盐水将菌体洗涤 2～3 次，制成菌悬液。

1.3 用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为 10³ 个/毫升。

2. 平板制作

将淀粉琼脂培养基融化，倒平板 27 套，凝固后待用。

3. 紫外线处理

3.1 将紫外线开关打开预热约 20 min。

3.2 取直径 6 cm 无菌平皿 2 套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液 3 ml，并放入一根无菌搅拌棒或大头针。

3.3 将上述 2 套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开板盖，在距离为 30 cm，功率为 15 W 的紫外灯下分别搅拌照射 1 min 和 3 min。盖上皿盖，关闭紫外灯。

照射计时从开盖起，加盖止。先开磁力搅拌器开关，再开盖照射，使菌悬液中的细菌接受照射均等。操作者应戴上博利眼镜，以防紫外线伤眼晴。

4. 稀释

用 10 倍稀释法把经过照射的菌悬液在无菌水中稀释成 10^-1～10^-6。

5. 涂平板

取 10^-4、10^-5 和 10^-6 三个稀释度涂平板，每个稀释度涂 3 套平板，每套平板加稀释菌液 0.1 ml 用无菌玻璃涂棒均匀地涂满整个平板表面。以同样的操作，取未经紫外线处埋的菌液稀释涂平板作为对照。

从紫外线照射处理，直到涂布完平板的几个操作步骤都需在红灯下进行。

6. 培养

将上述涂匀的平板，用黑色的布或纸包好，置 37℃ 培养 48 h。注意每个平板背面要事先标明处理时间和稀释度。

7. 计数

将培养好的平板取出进行细菌计数。根据对照平板上 cfu 数，计算出每毫升菌液中的 cfu 数。同样计算出紫外线处理 1 min 和 3 min 后的 cfu 数及致死率。

8. 观察诱变效应

选取 cfu 数在 5～6 个左右的处理后涂布的平板观察诱变效应：分别向平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC 比值）。与对照平板相比较，说明诱变效应，并选取 HC 比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。