亚硝基胍法

亚硝基胍（NTG，N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍）是一种有效的化学诱变剂，在低致死率的情况下也有很强的诱变作用，故有超诱变剂之称。它的主要作用是引起 DNA 链中 GC→AT 的转换，亚硝基胍也是一种致癌因子，在操作中要特别小心，切勿与皮肤直接接触。凡有亚硝基胍的器皿，都要用 1 mol/L NaOH 溶液浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏。

1.1 将试验菌斜面菌种挑取一环接种到含 5 ml 淀粉培养液的试管中，置37℃ 振荡培养过夜。

1.2 取 0.25 ml 过夜培养液至另一支含 5 ml 淀粉培养液的试管中，置 37℃ 振荡培养 6～7 h。

2. 平板制作

将淀粉琼脂培养基礅化，倒平板 10 套，凝固后待用。

3. 涂平板

取 0.2 ml 上述菌液放到一套淀粉培养基平板上，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂满整个平板表面。

4. 诱变

4.1 在上述平板稍靠边的一个位点上放少许亚硝基胍结晶，然后将平板倒置于 37℃ 恒温箱中培养 24 h。

4.2 放在亚硝基胍的位置周围将出现抑菌圈（图 1）。

图 1　亚硝基胍平板诱变

5. 增殖培养

5.1 挑取紧靠抑菌圈外侧的少许菌苔到盛有 20 ml LB 液体培养基的三角瓶中，摇匀，制成处理后菌悬液，同时挑取远离抑菌圏的少许酋苔到另一盛有 20 ml LB 液体培养基的三角瓶中，摇匀，制成对照菌悬液。

5.2 将上述 2 只三角瓶置于 37℃ 振荡培养过夜。

6. 涂布平板

分别取上述两种培养过夜的菌悬液 0.1 ml 涂布淀粉培养基平板。处理后悬液涂布 6 套平板，对照菌悬液涂布 3 套平板。涂布后的平板，置 37℃ 恒温箱中培养 48 h。实际操作中可根据两种菌液的浓度适当地用无菌生理盐水稀释。注意每套平板背面作好标记，以区别经处理的和对照。

7. 观察诱变效应

分别向 cfu 数在 5～6 个左右的处理后涂布的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圏直径与蓠落直径并计算其比值（HC 比值）。与对照平板相比较，说明诱变效应，并选取 HC 比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。

凡有亚硝基胍的器皿，都要置于通风处用 1 mol/L NaOH 溶液浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。