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科研学霸天团,48小时有问必答
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有关pcr mapping分析基因环境结构的问题
Eason老歌迷
引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp。引物GC含量一般为40%-60%, 45-55%为宜。引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间。可以用ncbi查,然后用Primer Premier设计
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问
细菌质粒构建如何确保准确
天一湖医者
保存质粒用的菌宿主需要小心选择,因为有不少菌株已经工程化,有些缺失了某些纠错系统,有些则还保留着重组体系。典型的是最好不要用表达载体保存质粒,如BL21(DE3)就不适合,由于其没有缺失重组酶RecA。具体可以看各菌株的基因型。常用于保存质粒的菌株有DH5a, XL1-blue, TOP10等。
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问
跑PCR,遭遇没有目标引物序列出现
天一湖医者
你拿到的测序结果,是从引物开始后面30-50个碱基以后开始的序列,引物序列是看不到的。这个和测序机器的性能有关。一般从引物开始的一小段序列出峰会很不稳定,有稳定峰图可以读出序列一般都是20-30个碱基之后了。你手头若是有峰图结果你看看最开始那段的峰图就知道了。至于拿到的序列到底是什么,ncbi上blast一下不就什么都知道了
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问
WB没有目的条带,咋回事
天一湖医者
蛋白提取的不好;样品保存不当;处理条件不对;甚至有些WB操作问题等等
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问
质粒过表达1000多倍,这正常吗???
灵枢天问
正常的。如果本身表达够低,这种情况就很正常
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问
是否可以对入噬菌体直接进行LA PCR反应?
未来9
可以的,可以直接对菌体直接进行LA PCR反应
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问
对Mammalian cell或E. coli只进行热处理 98℃,2 min或Protease处理的样品可否进行LA PCR?
bamboopiggy
不太合适,因为模板这么处理不纯,LA pcr的结果会不好。
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问
使用LA Taq是否也产生A的Overhang? (PCR产物是否可直接克隆于T-vector中?)
bamboopiggy
LA taq扩增得到的PCR产物的3’端常附有一个"A"碱 基,可直接克隆于T-Vector中
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问
如何在共有序列巢式PCR实验中减少假阳性?
天一湖医者
1.戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;2.使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;3.避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;4.操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,
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问
PCR的循环数可以超过35吗?
未来9
一般不超过35次。随着反应时长加长,会导致非特异性产物相应增加产生干扰;另外设计实验的时候减少循环次数可以减少使用量缩短时间。
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问
PCR实验的酶该怎么选择?
未来9
根据考虑的指标,如特异性、灵敏度、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等,我们将主要的Taq酶归归类,其性质、用途也就一目了然了。
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问
PCR的延伸温度是怎么调整的?
天一湖医者
PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。
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问
qPCR试剂盒放了一年还能用么?
未来9
可以的。荧光定量PCR试剂盒保存条件: 收到本产品后,请立即置于-20℃避光保存,一年有效。
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问
RT-PCR的数据处理方法如何选择?
未来9
常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法, ΔCt法, 2-ΔΔCt法(Livak法),用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。对比如下图:
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问
qPCR时,cDNA的浓度怎么控制在同一浓度范围?
天一湖医者
一般提取组织后测RNA的浓度,然后反转录的时候保证reaction mixture里面RNA的量是一样的。然后你反转录成了cDNA。这个时候不必要测浓度。因为你的反转录体系都是一样的,理论上讲(建议用multipipetide)你生成的cDNA也是一样的。
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问
qPCR重复性不好,怎么避免?
天一湖医者
造成qPCR实验重复性不好的原因有以下几点:① 移液枪不准,加样不准确这种情况下,我们可以更换性能更好的移液枪,扩大反应体积,将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中② 定量PCR仪在不同位置温度不一样这个需要定期校准定量PCR仪③ qPCR预混液未混合均匀使用前应充分混匀qPCR预混液
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问
RT-PCR的体系的构成?
天一湖医者
PCR反应体系由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA聚合酶、靶序列DNA和PCR反应缓冲液体系组成。
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问
乳液PCR有了解的么?
汤姆卜丽波
有专用的孔隙大,低吸附的枪头,用那种试试
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问
NEAT1基因有两个转录本,长的转录本是在短的转录本基础上的延长,这种情况下怎么设计针对短转录本的特异引物?
Eason老歌迷
NEAT1基因其实有两个转录本:NEAT1_1和NEAT1_2, NEAT1_1(3.7 kb in humans, 3 kb in mice)与NEAT1_2 (23 kb In humans, 20 kb in mice)的5’末端完全重合,两个转录本均只包含一个外显子,而且均留在核内。NEAT1_1多聚腺苷化,类似于mRNA,而NEAT1_2对paraspeckles至关重要,构成其“arc
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问
RT-PCR结果中出现undetermined
汤姆卜丽波
是不是加样问题,惯性操作,加到那个孔样品不够了
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