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科研学霸天团，48小时有问必答

问PCR扩增不出DNA？

我的头痛不再痛

1、其实产物和marker比起来大小上有点偏差是很正常的，包括蛋白在内的分子标量，有时候不是那么准确，这个不必担心，只要差别不是很大就可以。完全可以通过测序去验证。2、之前能扩增出来，后来就扩增不出来，相同的扩增条件和体系，那是否就是模板的问题呢？比如你使用了新的模板，这样就有可能是你模板的质量或浓度问题。

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问电泳时条带跑出凝胶，是什么情况？

我是金博士

这是你跑电泳时间太长了。

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问荧光定量的 CT 值有正常范围吗？

张法丽

一般在15-35左右，如果数值再大，可能这个基因的拷贝数太低了，表达量太少

13 回答9700 围观

问溶解曲线代表什么意思？

alaling

熔解曲线(Dissociation curve)：随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系（摘自搜搜百科）。白话说来就是因为其中有非特异产物，包含两种以上的DNA序列，所以才有两个峰。当然不排除极度偶然的情况：1.两个序列的熔解曲线一样2.没有目标产物，只有一种非

10 回答19463 围观

问请问 PCR 程序最后给出的 RQ 值是否可以直接用来统计？

qianliu185676911

PCR反应中,CT值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；RQ值是比较的Ct值。它经过数学公式变形而来。它是判定实验样品中目标靶位点与在标准样品中相同靶位点的表达变化情况。

1 回答3890 围观

问实时荧光定量 PCR 实验重复不出来是怎么个情况？

hml04010418

没有具体信息。每次条件的一致包括样本处理的一致。

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问real-time PCR 与 reverse-transcription PCR 有什么区别？

woodeygao

reverse-transcriptionPCR是把提取的RNA逆转录成为cDNA，RNA——cDNA，靠的是逆转录酶；RT-qPCR，Real-Time定量PCR，是用来扩增DNA，和普通PCR方法不同是加入了荧光染料（楼上说的SYBR只是一种），通过检测器检测到荧光信号变化来对扩增的DNA进行定量，DNA-DNA，靠的是DNA合成酶和DNA外切酶。简单来说reverse-transcripti

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问实时荧光定量 PCR 一定要设标准品吗？ΔCT 和 ΔΔCT 哪种方法好？

prime0711

我用的是ΔΔCT，没有用过标准品

5 回答1734 围观

问高保真酶怎么选择？

大明天桃子

传统的高保真酶例如pyrobest没有什么可说的，保真性一般是普通Taq酶的10倍以内。但传统的高保真酶最大的缺点是扩增能力差，长一点儿的基因很难有效扩增，要摸很多条件，一个字麻烦。最近可以买到的高保真酶选择的机会多一点儿了，有宝生的primer star，还有人提示的Taq plus（这个酶没有详细了解过），上述这两个酶的扩增能力我没有详细了解过，有兴趣的可以去打听一下。最高保真的酶可能要数NE

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问如何根据CT值计算分析实验结果？

此用户已注销

内参大概16-22之间吧，太靠后也不好；目的基因，最好30之前，但有的情况，起峰会很晚，最好做无模版对照，即NC对照，NC理论上不会起峰，或在NC之前5-6个起峰的数值可用；

4 回答2995 围观

问同一批MIX，同一条件，同一批PCR，同一块胶，同一电泳，为什么差别就这么大呢

wisdyadong

胶配的不均匀！

8 回答2667 围观

问定量PCR的扩增曲线不平滑是为什么？

gjh731

1，体系不稳定，加大体系，2，如果是国产试剂的话可能这种现象算正常的，因为每次循环完后读荧光时，国产的染料不一定每次都结合的到DNA上，因此即使扩增出片的，也可能因为染料无法结合到DNA导致荧光值上下波动。3，引物扩增效率不高，非特异性不强，4，延伸出问题，可以考虑72度延伸时间增长，

3 回答3148 围观

问目的基因mRNA表达量一定会比GAPDH低吗？

tntztyx

可以在NCBI看一下spc的基因表达特异性

2 回答2384 围观

问做QPCR需要跑电泳吗？

修玛杨

紫外分光光度计检测的是RNA的浓度及是否有蛋白、酚类（就是在氯仿离心取上清的时候是不是吸到了中间层和下层，已经酒精洗异丙醇是否完全）的污染，而RNA电泳则是检测提取的RNA这个过程中是否有降解，如果是miRNA还好一些，如果是mRNA，一旦你的目的mRNA被降解了（也就是RNA电泳出现了3条以上的条带或者18s，28s不合格），那后续实验也就没有必要了。所以，我认为，要想出一个靠谱的实验，也为了避

2 回答4828 围观

问逆转引物的选择问题

parashorea

如果你的逆转录的目的是QPCR的话，选择同时含有oligo T 和Random primier双引物，如果你的目的是克隆基因的话，选择oligo dT.

2 回答702 围观

问目的基因片段电泳鉴定无结果是为什么？

hl16010921

1.先对比引物序列，看序列是否真的评分很高（文献的也要自己重新查，文献审稿时引物错误是没人挑的）2.引物质量很重要，PCR不出结果，可以不付帐。换一家试试。有的公司引物合成时好时坏。3.引物的保存不当。4.PCR体系中有强的抑制Taq的物质（抽提污染或水的质量不高）5.是否有引物二聚体？有的话证明PCR还在进行，但条件不好。如果没有证明PCR没进行。6.dNTP降解也有可能。7。ULYSSEESW

2 回答1604 围观

问求助啊 Promega 的 Psi-check 2 vector 的测序引物是什么呀

iternol

psiCHECK-F GCAACTACAACGCCTACCTTCGG psiCHECK-R CGAAAAGGTCACACTCTGGGGCG你再网上找到质粒序列后就可以找到引物的位置了

2 回答2363 围观

问乙肝病毒的纯度 OD260/280 比值高是为什么？

alaling

如果不放心，比较好的办法是可以用RNA酶处理下。

3 回答1472 围观

问mg2+浓度是如何影响PCR扩增效率的?

我是金博士

PCR要用到聚合酶，酶的反应需要镁离子催化。

2 回答1287 围观

问请问裂解细胞进行检测，最少多少动物量就可以完整检测一次

月亮先生

我用七八万的目的细胞群，也能做出荧光定量的实验。就是出峰可能晚了一点

3 回答1242 围观

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