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问
荧光定量PCR冰上操作
未来9
是的,RNA很容易降解,尤其在水溶液中,提取时尽量在低温进行如果操作时间长,降解太多,肯定会影响实验结果
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问
重叠pcr没有条带,试过不同模板浓度,不同tm值,不同保真酶,怎样才能重叠成功?
微暖
引物设计:第一条片段的反向引物包含第二条片段的25bp左右,第二条片段的正向引物包含第一条片段的25bp,引物长度大概50多bp。分别扩增两条片段。以这两条片段为模板,第一条片段的正向引物和第二条片段的反向引物,pcr扩增就好了。
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问
为什么在FAM VIC ROX CY5四个通道下,在做试剂加速的时候,FAM通道总是扩增变差?
n0y0j7
四个通道波长不一样,还是fam用的多,性能变差
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问
引物设计及内参问题(救救)
cxsm
这个检测的是人的前列腺癌的基因变化,应该用人的。
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问
各位朋友,请问病毒反转录体系中加入RNA样本的量要怎么确定呢?
bamboopiggy
说明你的rna测得浓度有问题,你先看那你的rna的260/230,260/280 是不是在1.8-2.0之间,如果低于这个数值,说明你测得rna得浓度,比实际浓度要高,你需要改善你提的rna的质量。
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问
PCR引物设计及内参
天一湖医者
引物设计用动物基因好就可以内参也可以用动物源设计
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问
在NCBI上检索RORγt的RNA编码,发现有isoformX1、2、3和4这四种型别?请问该怎么选?
bamboopiggy
选四个isoform都包含的片段来检测rna,除非你的组织中有多种isoform,你又要区分
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问
cDNA在-20℃可以保存多久?
dxy_0vzvh5k
-20℃保存半年没问题,不要反复冻融。
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问
qRT-PCR结果如何用SPSS软件分析差异?
bamboopiggy
你只要把ct拿到按照deltadelta ct法的计算公式,得到基因的拷贝数,用excel也能算
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问
琼脂糖凝胶电泳,制备的胶块在紫外下就像是星星一样,特别亮,请问是什么原因呢?
dxy_gwrp7ndq
基因组污染了,很多RNA停留在孔中或者出孔很慢。
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问
PCR实验结果,无内标基因的扩增曲线是与采样操作、核酸提取有关吗?
府宅
内部无扩增但靶序列有扩增有可能是细胞本来就没有此内部基因,也有可能是本身模板就没提出来,然而在PCR过程中被污染,使得靶基因被扩增出来了。
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问
qpcr出现低置信区间等问题
bamboopiggy
1.你先确定你rna浓度够不够,逆转的效率如何?2.你操作过程中,所有东西都加全了?酶,引物,cDNA?3.你pcr程序是不是有问题?
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问
CT值在40以上的时候,是否可靠
Topmicro
一般不可靠,你做实验的时候要加入纯水做阴性对照,对结果的判定也要比较样品ct值和阴性对照的ct值。
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问
qPCR引物做預實驗融峰曲線是單峰但是ct值比較高,樣本cDNA-20放置半年,是不是應該考慮樣本的問題
bamboopiggy
对,cdna虽然很tough但是如果-20放半年还是会有降解的。ct值会变高
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问
为什么在做菌落PCR鉴定的时候阴性对照(模板为水)也能P出条带?
zj佐罗
可能存在污染的风险。建议重新做,排查是否是试剂问题还是水的问题。
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问
PCR样品太多时,同一样品的内参结果可以用在其他批次的样品中嘛?
zj佐罗
可以,但不提倡,如果你是老鸟,手法稳(指批次差异不大)可以用,如果菜鸟,建议每次做内参。
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问
用软件进行PCR引物设计时,怎么确保产物长度,怎么设计可以让引物在目的基因起始端
zj佐罗
直接在基因起始点选定引物,设定产物长度。
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问
关于PCR的相关知识提问
bamboopiggy
就是把你要克隆的片段两头各取15个碱基,加上酶切位点和三个保护碱基就好。
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问
家人们,做实验的时候,如何才能更好地避免引物被污染啊?
bamboopiggy
在配引物mix的时候,不要碰样品,把引物配好,都收起来只留mix,分装以后,再去碰样品
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问
q-PCR 有的组织样β-actin有双峰,有的组织又没有这是为什么鸭?求解答
dxy_gwrp7ndq
可能是beta-actin基因特异性不强,荧光定量PCR对引物的要求很高,就导致双峰
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