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荧光定量PCR时应该注意什么?

相关实验:重叠延伸 PCR

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郭瞧瞧gg

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4 个回答

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Eason老歌迷

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它的关键步骤在于RNA的抽提和引物的设计。RNA的抽提需要严格进行RNase free的操作,抽提的RNA OD260/OD280需严格控制在1.9-2.1之间。引物设计主要的考虑是其PCR反应特异性好和扩增效率高,进行PCR反应时无非特异性的条带和引物聚合体出现,尽量选取GC含量在40-60%的区段进行扩增。另外,还需要适应荧光定量PCR仪上机条件的设定,退火温度在55-65℃之间。除此之外,其他各个环节如试剂的稳定性,RNA反转的质量好坏,PCR上机条件的设定,加样的手法和熟练度等等也要注意。

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未来9

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实时荧光定量PCR实验需要先制备混合反应液,大剂量包装的反应试剂,使用前进行分装,尽量减少试剂的反复冻融。建议所有样本要有三个重复。实验操作过程时需注意以下几点,有利于避免实验污染问题。1.用稀释的漂白剂或净化剂擦拭净化台。2.在的配有紫外灯超净式或者超静台中准备样品,理想的是样品的准备与PCR的扩增分开在不同的区域完成。3.在样品制备和配制反应过程中要勤换手头。4.勤用稀释的漂白剂擦拭移液器。5.只使用PCR级的水和PCR试剂进行PCR实验。5. 用带旋盖的 EP 管稀释和配制反应液。6. 在进行 PCR 实验时,还应准备一个无模板的对照来验证有无污染发生,而且用热启动酶防止反应开始之前的非特异性扩增。

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汤姆卜丽波

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首先就是RNA浓度要有一定保证,不要降解,然后逆转录后,pcr.加样要准确,体系对了基本上没问题

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bamboopiggy

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设计好引物,rna的质量要好,加样要准确

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