荧光定量PCR时应该注意什么？

它的关键步骤在于RNA的抽提和引物的设计。RNA的抽提需要严格进行RNase free的操作，抽提的RNA OD260/OD280需严格控制在1.9-2.1之间。引物设计主要的考虑是其PCR反应特异性好和扩增效率高，进行PCR反应时无非特异性的条带和引物聚合体出现，尽量选取GC含量在40-60%的区段进行扩增。另外，还需要适应荧光定量PCR仪上机条件的设定，退火温度在55-65℃之间。除此之外，其他各个环节如试剂的稳定性，RNA反转的质量好坏，PCR上机条件的设定，加样的手法和熟练度等等也要注意。

实时荧光定量PCR实验需要先制备混合反应液，大剂量包装的反应试剂，使用前进行分装，尽量减少试剂的反复冻融。建议所有样本要有三个重复。实验操作过程时需注意以下几点，有利于避免实验污染问题。1.用稀释的漂白剂或净化剂擦拭净化台。2.在的配有紫外灯超净式或者超静台中准备样品，理想的是样品的准备与PCR的扩增分开在不同的区域完成。3.在样品制备和配制反应过程中要勤换手头。4.勤用稀释的漂白剂擦拭移液器。5.只使用PCR级的水和PCR试剂进行PCR实验。5. 用带旋盖的 EP 管稀释和配制反应液。6. 在进行 PCR 实验时，还应准备一个无模板的对照来验证有无污染发生，而且用热启动酶防止反应开始之前的非特异性扩增。

首先就是RNA浓度要有一定保证，不要降解，然后逆转录后，pcr.加样要准确，体系对了基本上没问题

设计好引物，rna的质量要好，加样要准确