【求助】请教提取核蛋白的方法，应该注意什么？

最近要提取核蛋白，看NF-KB的近核情况，然后做western，师姐用了碧云天的试剂盒，但是提的不好，基本没有提出来，实验室其他人也用过，感觉也不是很好。
请教高人指点，提供些经验！谢谢！

Pierce的胞浆、胞核蛋白抽提试剂盒

pierce 的比较好是吧？谢谢了。。那只要跟着它的试验步骤做就行了嘛？

这是本人所用的核蛋白提取方法，简单方便，提出的核蛋白我用来作EMSA, 检测蛋白核转移，从来没有问题。

t太感谢你了！

太好了

上海生工有 021-37772436

细胞核蛋白质提取试剂盒
Nucleoprotein Protein Extraction Kit

产品说明：本试剂盒提供独特的组份，采用特殊的非离子型去污剂，以及焦磷酸钠等数种蛋白磷酸酶和蛋白酶抑制试剂，能够在非变性和低渗的条件下裂解细胞，经过洗涤去除大部分胞质蛋白和膜蛋白，释放的细胞核能够保持完整，再用Lysis Buffer对细胞核蛋白质进行抽提的同时可以保持核蛋白质的活性，因此该产品可合适用于SDS-PAGE电泳、Western Blot、免疫共沉淀，EMSA，Pull Down, 转录调控等后续蛋白质或分子生物学相关实验的研究，每次可以从107个培养细胞或200mg动物组织提取核蛋白质，本试剂盒可以使用50次。储存条件：2-～8℃

产品特点：

1．提取的核蛋白质可以最大限度的保持蛋白质的活性，可以用于EMSA，转录因子分析的实验;

2．可以从50x107个培养细胞或50x200mg动物组织提取核蛋白;

3．整个实验过程只需要45分钟左右;

4．在提取的过程中，最大限度的减少了膜和胞质蛋白对核蛋白的污染;

5．不需要超速度离心，可以同时处理多个样品。

编号 包装 价格 产地
BSP009 50 Assays 300 生工

细胞核蛋白/浆蛋白抽提试剂盒
Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit

产品说明：本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和胞质蛋白，提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性，并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究，可以每次从1×107个培养细胞或200mg 组织中提取所需要的蛋白质，可以使用50次。储存条件：2-～8℃。

产品特点：

1．最大限度保持蛋白质活性，可以用于EMSA，Pull down,Enzyme activity assay等实验；

2．整个操作过程只需要一个小时左右；

3．即可以用于培养细胞（50x107个），有可以用于动物组织（50x200mg）蛋白质的提取；

4．避免蛋白酶对蛋白质的降解，保持蛋白质的完整性和天然活性；

5．可以同时处理多个样品。

编号 包装 价格 产地
BSP001 50 Assays 520 生工

这是本人所用的核蛋白提取方法，简单方便，提出的核蛋白我用来作EMSA, 检测蛋白核转移，从来没有问题。

请问 1. Centrifuge at top speed for 3min at 4OC. top speed 有多top 啊，是多少g 或转啊

2 。 Estimate the volume of nuclear pellet and add 3x volumes of ice-cold buffer B containing 1mM DTT and 1x PI. Incubate on ice of 30 min with intermittent strong vortexing. 间断涡旋是每隔多长时间涡旋多长时间啊？

谢谢

Thanks!

我用碧云天的试剂盒提也没问题，重要的两点是 细胞种密一点，然后蛋白酶抑制剂用cocktail

请问，上海生工的胞浆胞核蛋白提取盒，在提取组织蛋白时，是怎么提的，步骤4时需要估计紧密细胞的体积是什么意思？
是否可以按照称取的蛋白的质量来加bufferA呢？：我称取了100mg组织，经过步骤123后，是否直接加0.5ml的bufferA呢？
敬请指教。

Thanks!

大侠们 你们提完核蛋白 应该要检测一个内参蛋白用以评价胞核分离效果 请问大家都是用什么内参蛋白呢？

配方有点看不懂，buffer B 意思是这样吗： 最左边一列是裂解液的工作浓度，for 50ml ：意思是先配制50ml的裂解液，分别加入1M HEPEs,pH7.9 1ml; 5M Nacl 4ml ; 0.1M EDTA 500ul ; 0.1M EGTA 500ul ;ddH20 48.9ml ?怎么最终体积超过了50ml?