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透射电镜的基本结构和原理

电子显微镜(electron microscopy,EM) 简称电镜,经过五十多年的发展已成为生物学、医学、化学、农林和材料科学等领域进行科学研究的重要工具,是人类认识自然,特别是研究机体微细结构的重要手段,电镜技术已成为上述各领域研究工作者应掌握的一项基本技能。电镜的创制者鲁斯卡(E.Ruska)教授因而获得了1986年诺贝尔奖的物理奖。 与光镜相比电镜用电子束代替了可见光,用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见 ...

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共聚焦激光扫描显微镜的应用及荧光探针

一、LSCM常用的检测内容及其荧光探针 LSCM检测内容和应用范围非常广泛,以下仅简单介绍LSCM常用的检测内容及其荧光探针。 1.细胞内游离钙 共聚焦激光扫描显微镜常用的有Fluo-3、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等,前两者为单波长激光探针,利用其单波长激发特点可直接测量细胞内Ca2+动态变化,为钙定性探针;后两者为双波长激发探针,利用其双波长激发特点和比率技术,能定量细胞内i,为钙定量探针。 定量细胞内i也可用双波长 ...

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共聚焦荧光探针标记方法

(一)BCECF测定pH值 1. 储存液配制 BCECF-AM溶于DMSO配成1mmol/L溶液,等份分装后,-20℃避光保存。 2. 染色步骤 将培养细胞用PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。加入BCECF-AM(终浓度1~5μmol/L),37℃孵育30~60min。PBS(含Ca2+、Mg2+)洗2遍。激光扫描共聚焦显微镜观察。 (二)SNARF-1定量比率测定pH值 1. 储存液配制 SNARF溶于DMSO配成1mmol/L溶液,等份分装后,-20℃避光保存。 2. 染色步骤 将 ...

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激光扫描共聚焦显微镜技术原理

光学显微镜作为细胞生物学的研究工具,可以分辨出小于其照明光源波长一半的细胞结构。随着光学、视频、计算机等技术飞速发展而诞生的激光扫描共聚焦显微镜 (Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM),则使现代显微镜有能力研究和分析细胞在变化过程中的结构。特别是对活细胞离子含量变化的定量检测、完整细胞的三维立体结构图像重建等方面,是传统的光学和电子显微镜所望尘莫及的。 Marvin Minsky于195 ...

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扫描电镜的基本结构和原理

扫描电镜成像方式与透射电镜不同,是用电视的方式成像。其基本要点是用极狭窄的电子束来扫描样品,即电子束在样品上作光栅运动。电子束与样品相互作用将会产生样品的二次电子发射,二次电子能产生样品表面放大的形貌像,这个像是在样品被扫描时按时序地建立起来的,即用逐点成像的方法获得放大的像。   一、基本结构 扫描电镜主要是由电子光学系统和显示单元组成,它是由电子枪、磁透镜、扫描线圈以及样品室组成(图19-6)。电子枪与透射电镜的电子枪基 ...

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细菌培养检测技术

细菌大多数属异养菌,必须从周围环境中摄取营养,进行新陈代谢及生长繁殖等生命活动。不同细菌的生长条件不尽相同,针对不同的病原菌,选择最佳培养条件,可提高临床分离培养的阳性率,缩短诊断时间。观察不同细菌在人工培养基上的各种代谢活动,可用作鉴别菌种及解释细菌致病性的依据。  一、培养基的分类1. 培养基是人工配制的适合细菌生长繁殖的混合营养制品。培养基按其物理状态可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基三类。(1)液体培养基:液 ...

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流式细胞术的样品制备

(一)不同来源样品的处理 1. 培养细胞 (1)培养细胞用0.25%的胰酶消化。 (2)PBS或生理盐水洗涤细胞2次,再用PBS或生理盐水悬浮细胞,加入预冷的无水乙醇,终浓度为60%~70% ,快速混匀,并用封口膜封口,置4℃下可保存15天左右。 2. 新鲜标本 (1)将标本切成1~2mm3的小块。 (2)PBS或生理盐水清洗后去除上清,加入0.2%胶原酶(或0.15%胰蛋白酶)37℃消化10~30min(根据实验及不同组织确定),并不断振动。 (3)300目尼龙筛过滤, ...

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流式细胞术的应用

(一)流式细胞术在细胞生物学中的应用 流式细胞术最早被应用于生物学研究领域,就是生物细胞周期和动力学的分析。近年来,DNA倍体分析已经越来越广泛应用于临床和基础研究,发挥越来越重要的作用。 1. 有利于肿瘤的早期诊断和鉴别诊断 良性肿瘤或良性增生时不会出现非整倍体细胞(DI>1),而恶性肿瘤则伴有相当数量的非整倍体出现,相当部分癌前病变也有非整倍体的出现。所以非整倍体细胞是判断肿瘤恶变的一个重要标志。 2. 有利于判断肿瘤的预后 有学者研 ...

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流式细胞术的基本理论

1. 工作原理 流式细胞仪主要由流动室及液流系统、激光器及光学系统、光电管及检测系统、计算机及分析系统四个部分组成,见图18-1。 待测细胞被制备成单细胞悬液,经特异性荧光染料染色后置于专用样品管中,在气体压力推动下被压入流动室,流动室内充满鞘液(不含细胞或微粒的缓冲液),在高压作用下从鞘液管喷出包裹细胞,使细胞排成单列形成细胞液柱,依次通过检测区。液柱与高度聚焦的激光束垂直相交,被荧光染料染色的细胞受到激光激发产生荧光信号 ...

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细菌形态检查法

细菌形态学是研究细菌的一个重要方面,了解细菌的形态和结构对研究细菌的生理活动、致病性和免疫性,以及鉴别细菌、诊断疾病和防治细菌性感染等均有重要的理论和实际意义。由于细菌个体微小,常以微米(μm)为测量单位,肉眼不能直接看到,必须借助显微镜放大后才能观察。根据不同的研究目的和要求,可分别选择普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。另外,由于细菌呈半透明状,要想更清楚地观察其大小和形态,需要 ...

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制片技术

随着生物学和医学的发展,生物学染色技术也不断地改进和发展。利用组织切片染色方法所制出的标本,可以显示各种组织细胞的不同结构和形态,还可以显示细胞和组织中某些化学成分含量的变化。组织制片及组织染色技术在医疗科学领域里占有重要地位,是教学、医学和科研中不可缺少的一个组成部分。组织学切片所需的组织,除一部分可取自人体外(如外科手术活检组织或尸检的新鲜材料),大部均取自动物。其过程包括组织(细胞)取材、固定、包埋、切片、染色 ...

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单克隆抗体技术

1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖,从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元,也为临床疾病的诊断、预防和治疗提供了新的方法。 1. 杂交瘤的基本原理 杂交瘤技术又称单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)。杂交瘤技术是使免疫动物的脾细胞在聚乙二 ...

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直接凝集反应

某些病原微生物或红细胞悬液等颗粒性抗原与相应抗体结合,在有适量电解质存在下,经过一定时间出现肉眼可见的凝集小块,称为凝集反应(agglutination)。根据反应的方式不同,凝集反应可分为直接凝集反应、间接凝集反应和抗球蛋白试验等。直接凝集反应时颗粒性抗原和相应抗体直接结合,在有电解质存在的条件下,出现肉眼可见的凝集小块,为直接凝集反应。有玻片凝集法和试管凝集法。前者是一种定性实验,多用已知诊断血清检验未知抗 ...

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细胞杀伤活性检测技术

细胞毒检测技术包括补体依赖细胞毒试验、NK细胞介导的细胞毒试验和特异性CTL活性检测,常用的实验技术有后两种。NK细胞(natural killer cell)是在天然免疫系统发挥主要作用的效应细胞,可直接杀伤病毒感染的靶细胞和某些肿瘤细胞。而细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)则是特异免疫系统发挥特异杀伤作用的效应细胞,可特异杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞。本节介绍乳酸脱氢酶(LDH)释放 ...

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免疫标记技术

免疫标记技术(immunolabelling techniques)是指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂作为示踪物,标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应,借助于荧光显微镜、酶标检测仪等仪器,对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定,可在细胞、亚细胞以及分子水平上,对抗原抗体反应进行定性和定位研究;或应用各种液相和固相免疫分析方法,对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性定量测定。根据标记物的种类和 ...

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姐妹染色单体分化染色

1. 实验原理 姐妹染色单体分化染色法(Sister chromatid differentiation,SCD)是20世纪70年代中期发展起来的染色体处理技术。1973年Latt在培养的细胞中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromode Oxyurdine,BrdU),用Hoechst 33258 荧光染料染色时,发现了姐妹染色单体的色差反应和它们之间互换的现象。1974年KO Renberg和Froeed-Lender改进了这一技术,用G ...

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小鼠骨髓的染色体制备

1. 实验原理 小鼠骨髓细胞有高度的分裂活性,并且数量非常多,因此不必进行体外培养,可直接观察到分裂期细胞。处于分裂期的细胞经秋水仙素处理,阻断纺锤丝的形成,使细胞分裂停止于中期,此时染色体达到最大收缩,具有典型的形态。低渗处理使细胞破裂,便于染色体分散。该方法在临床上多用于白血病的研究,也可用于观察毒性物质对机体遗传物质——染色体损伤的状况。 小鼠染色体2n=40,均为端着丝粒染色体, 雄性为40,XY,雌性为40,XX。 2. 实验试剂与器材  ...

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小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的测定法

1. 实验原理 染色单体或染色体的无着丝点断片,或因纺锤体受损而丢失的整个染色体,在细胞分裂后期,仍然遗留在细胞质中。末期之后,单独形成一个或几个规则的次核,被包含在子细胞的胞质内,因比主核小,故称为微核。大小应为主核的1/20~1/5。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。微核率是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关,所以可用简易的、快速、灵敏的微核计数来代替繁杂的畸变染色体计数。Matter 和Schmid建立的微核测试 ...

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多聚酶链式反应技术(PCR技术)

多聚酶链式反应即PCR(polymerase chain reaction)技术,应用这一技术可以将微量目的基因(DNA片段)扩增一百万倍以上。PCR反应理论的提出和技术的完善对于分子生物学的发展具有特殊的意义,它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法之一,并使得很多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。发明这一技术的K. Mullis因此贡献而获得了199 ...

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核酸探针标记及原位杂交

一、核酸探针标记 核酸探针分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。杂交的双方是待测核酸及探针。 核酸探针根据核酸的性质,可分为DNA和RNA探针;根据标记物不同,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针两大类;根据是否存在互补链,可分为单链和双链探针;根据放射性标记物掺入情况,可分为均匀标记和末端标记探针。下面主要介绍双链DNA探针及 ...

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