PCR (多聚酶链反应)

【实验目的】

掌握PCR技术的原理，学习PCR技术的基本方法，了解PCR技术的应用范围与意义。

【实验原理】

详见14章第2节。

【实验对象】

特定的DNA序列。

【试剂与器材】

引物(primer)，根据需扩增的DNA设计相应的引物；TagDNA聚合酶； 10×PCR缓冲液(随酶一起购买)；5mmol/L dNTP贮备液(商品化产品)；DNA模板(需扩增的 DNA)；双蒸水；矿物油；PCR反应管；微量移液器；离心机及PCR仪。

【实验方法与步骤】

标准的PCR操作程序是将各种所需反应成分分别加入PCR反应管中，然后根据具体的实验要求，设置一定的循环参数，进行循环扩增。具体如下：

(1) 向PCR反应管中依次加入

DNA模板 50～300ng (约为102～105拷贝DNA)

引物(3'→5'，5'→3')各 2μl 10μmol/L (终浓度为0.4μmol/L)

dNTP 2μl 5mmol/L (终浓度为0.2μmol/L)

10×PCR缓冲液 5μl 1/10体积 (终浓度为1×)

MgCl2 3μl 25mmol/L (终浓度为1.5mmol/L)

Taq DNA聚合酶 0.5μl (终浓度约1～5U/μl)

ddH2O 补到终体积为50μl，混匀后，离心15 s使反应成分沉于管底。

(2) 加入矿物油20～30μl（2～3滴），以避免反应液蒸发(有热盖的PCR仪可省此步骤)，然后将反应管置于95℃（变性）5min。

(3) PCR的循环程序一般为：94℃～96℃变性30s， 50℃～55℃退火30～60s，72℃延伸(1kb/1～2min)，循环25～30次。末次循环结束后，将反应管置于72℃温育5min，以确保充分延伸。

【实验结果检测】

PCR扩增产物的分析法：PCR扩增DNA片段只是一个重要手段，扩增片段的检测和分析才是目的，根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。

琼脂糖凝胶电泳可鉴定扩增产物的大小；点杂交技术除可鉴定扩增产物外，还有助于产物的分型；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小，增加检测的特异性与敏感性；最近发展的一系列产物分析法(PCR-ELISA、PCR-EIA、PCR-OLA等)均有助于PCR产物的精确分析。

【注意事项】

1. 引物的质量是保证PCR特异性的关键，引物过长或过短均会使特异性降低，以18～30bp为宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物内部和引物之间不应含有互补序列；引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%；

引物的3’末端与模板DNA一定要配对，但末端没有严格的限制，故引物设计时可在5’末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等；引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”；引物的终浓度一般为0.2～0.5μmol/L，过低会影响反应产量，过高会增加引物二聚或错配的几率。

2. Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但无3’-5’外切酶活性，因此对单核苷酸的错配无校正功能，发生碱基错配的几率为2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的优势在于反应产量高于其他DNA聚合酶。

Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人员心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶经基因工程改造后，新创出的Pfu Ultra具有更佳的校验活力。

数据显示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均错配率为Pfu DNA聚合酶的1/3，为Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/错误率) (数据来源：美国冷泉港实验室)。

3. Mg2+浓度也是影响反应效率和特异性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶对Mg2+浓度非常敏感，Mg2+可与模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根结合，不同反应体系中应适当调整MgCl2的浓度，一般以比dNTP总浓度高出0.5～1.0mmol/L为宜，Mg2+过量能增加非特异扩增。

4. dNTP的浓度过高会增加碱基的错误掺入率，使反应特异性下降；过低则会导致反应速度下降。使用时4种dNTP必须以等当量浓度配制，均衡的dNTP有利于减少错配误差和提高使用效率。

5. 温度循环参数中应特别注意复性温度，它决定引物与模板的特异性结合。退火复性温度可根据引物的长度，通过Tm＝4(G+C)+2(A+T) 计算得到。在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合。

6. 减低污染的常规措施：

①将PCR试剂、PCR产物及其他分子生物学试剂分开放置；

②应保持样品制备、PCR反应液配制与PCR产物分析三个工作区的独立性；

③使用阳性和阴性对照；

④使用最高质量的水配制PCR实验的所有反应试剂；

⑤配制好的PCR反应试剂应分成小包装储存，每个包装仅用于单次实验；

⑥制备样品、配制试剂及反应液时必须戴手套；

⑦实验前一定要认真清洁加样器等。

　思 考 题

1. PCR技术的基本原理是什么?

2. PCR的基本反应条件有哪些?

3. 哪些因素影响PCR产物的特异性?