​ 小载体聚合酶链反应

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诱变转座子基因组文库质粒DNA
锚定囊泡引物1和2 、1 mol L MgCl2、普通小载体（UV)和mTn引物、转座子诱变酵母菌株、合适的限制性内切核酸酶（如AZmI或DraI)和缓冲液、10×T4 DNA连接酶缓冲液、5 mmol L ATP、400 U μL T4 DNA连接酶（检测于黏合末端连接单位）、5 U μL Tag DNA聚合酶和1O×缓冲液、2.5 mmol L 4 dNTP 混合液
加热块、自动化热循环控制仪

1)准备小载体PCR，合成锚定囊泡引物。形成锚形囊泡如下：

a.配置一种水溶液，这种溶液中含有2〜4 mmol/L的每种锚定囊泡引物1和2。

b.在加热块上以95℃孵育5 min变性。

c.加入1 mol/L MgCl2至溶液终浓度为2 mmol/L

通过从底部装置撤掉加热块并将其放在试验台上直至冷却到室温使其变性。-20℃储存至第5步。

2)合成普通小载体（UV)引物。合成与产生插入文库的mTn互补的引物（mTn引物)。

如果使用LacZ插入文库，推荐以下序列为mTn引物：5'-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3、mTn引物对应于mTn-3× HA/LacZ的反义链上的LacZ的5'端序列。

UV引物在序列上与部分锚定囊泡引物2相同（不互补如果要分析一个mTn-3× HA /GFP诱变菌株，推荐使用以下GFP引物序列：5'-CAT CAC CTT CAC CCT CTC CAC TGA C-3'。

3)从目的转座子诱变酵母菌株制备基因组DNA

4)在20μL的反应体系中用10 U的AluI或DraI (经常用留有平端的刀片）消化1〜3μg基因组DNA, 37℃过夜。消化后，65℃孵育20 min灭活酶。

使用的酶不能切割转座子末端和mTn引物结合位点。

5)在步骤4的反应混合物中加入以下试剂：

5℃ 10×T4 DNA连接酶缓冲液

22.5μL灭菌水

1μL复性的锚定囊泡（在步骤1中得到）

0.5μL 5 mmol/L ATP

1μL (400 U) T4 DNA 连接酶

15% (m/V)聚乙烯乙二醇（任选）

16℃孵育9〜24 h

6)按照下列步骤制备总量为100μL 的PCR混合物：

A．从步骤5的连接反应体系中取出5μL

B．在这5μL的量中加入以下试剂：

10μL 1O×Taq PCR 缓冲液

7μL无菌水

8μL 2.5 mmol/L 4dNTP 混合物

2.5 20μmol/L mTn 引物（步骤 2)

2.5μL 20 pmol/L UV 引物（步骤 2)

1μL (5 U) Taq DNA 聚合酶。

7)将混合物转移到自动化热循环控制仪上92℃变性2 min。在以下条件下进行PCR反应

20 s 92℃(变性)

30 s 67℃(复性)

45 s 72℃(延伸)

90 s 72℃(延伸)

8)从步骤7的反应混合物中取出80 ,用非变性琼脂糖凝胶电泳法进行分析应该可以看到一约含有200〜400 ng的DNA条带。在TE 缓冲液中（约12μL)回收DNA。

9)用约4〜6μL的回收产物，作DNA序列测定，以鉴定mTn插入的确切位点。

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