聚合酶链反应

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。

开发史

这项技术的发明人是Kary Mullis.１９８３年，在一家生物高技术公司（Ｃｅｔｕｓ）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮＡ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法，即ＰＣＲ。在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。Ｃｅｔｕｓ给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短短的几年内，ＰＣＲ迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛的实际应用，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。１９９３年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。

原理和方法

众所周知，ＤＮＡ是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤Ａ对胸腺嘧啶Ｔ，鸟嘌呤Ｇ对胞嘧啶Ｃ）组成的螺旋双链。在细胞内，ＤＮＡ复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶－－ＲＮＡ聚合酶合成一小段引物（ｐｒｉｍｅｒ）结合到ＤＮＡ模板上，最后，ＤＮＡ合成酶以这段引物为起点，合成与ＤＮＡ模板配对的新链。ＰＣＲ即是在体外模拟ＤＮＡ复制的过程，它用加热的办法让所研究的ＤＮＡ片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到ＤＮＡ模板的两端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量复制该模板。

假定我们要研究的ＤＮＡ双链两端的序列是：

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在ＰＣＲ之前，我们首先人工合成两段有２０－３０碱基的引物，能够分别与上下两条链的一端配对，比如一条是（为与模板能够区别，以小写表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一条就是tttacggatcggcaacctat.把这两段引物和ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合在一起，我们就可以开始做ＰＣＲ了。

第一步叫“变性”，把样品加热到９４－９６摄氏度一到数分钟，让ＤＮＡ模板变性变成单链。

第二步叫“退火”，让样品的温度下降到５０－６５摄氏度一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.。.。.。.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT

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第三步叫“延伸”，让样品的温度上升到７２摄氏度一到数分钟，ＤＮＡ聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.。.。.。.。GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT

ataagcccgaaaggttcgttGATC.。.。.。.。CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.。.。.。.。GATCtatccaacggctaggcattt

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这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四条……在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍，而这只需要两三个小时。

ＰＣＲ要成功，必须要有能够忍耐高温、在高温下仍然能有活性的ＤＮＡ聚合酶。这种酶可从生活在温泉中的细菌中提取，其中最常用的一种叫Ｔａｑ聚合酶。野生型的Ｔａｑ聚合酶保真度较差，在复制比较长的模板时容易发生点突变。通过遗传工程，我们已获得了高保真度的Ｔａｑ聚合酶，大大提高了ＰＣＲ复制的精确程度。

应用

在分子生物学基础研究上，ＰＣＲ被广泛地用于基因克隆和制造突变。

在临床医学上，ＰＣＲ被用于鉴别遗传疾病和快速检测病毒、病菌感染。用传统的方法，要检测病毒、病菌的感染需要把病原体培养数周才能鉴定，而现在用ＰＣＲ，即可以迅速判断人体细胞（比如血液细胞）中是否存在病毒、病菌的ＤＮＡ（比如ＨＩＶ的ＤＮＡ）而确诊。

在法医上，ＰＣＲ目前已成为发现罪证的重要方法。比如，０·１微升的唾液痕迹所含的ＤＮＡ就可以通过ＰＣＲ扩增而获得足够量的ＤＮＡ进行测序鉴定罪犯。毛发、血迹、唾沫、精液因此都可以成为重要的罪证。

利用ＰＣＲ技术，科学家们已从林肯的头发和血液、埃及的木乃伊、琥珀中八千万年前的昆虫、恐龙的骨头等不寻常的样品中提取了足够的ＤＮＡ进行研究。博物馆中的化石标本都有可能成为遗传学的研究对象，一门分子古生物学因此诞生。