反向聚合酶链反应技术
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我们描述一种大聚合酶链反应(PCR)应用的方法，使在已知序列的核心区边侧的未知 DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR扩 增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区 的末端序列，但其方向性，使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。 这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列 探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。
引言
通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的，例如位于编码DNA的上游和下游两 侧的区域，转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上 的DNA片段末段的未知序列的探针等。这种末端特异探针在Southern Blot或染色体步 查(Chromosome walking)所需的噬菌斑杂交或克隆杂交中都十分有用。
要得到边侧序列的探针一般需要进行一系列费时、费力的工作，首先用内切酶裂解和 用已知边侧序列的探针Southern杂交以确定大小适合于克隆的末端片段;这些片段还 要经过凝胶分离、克隆，得到的物质再与已知边侧区域杂交以确定合适的克隆子。要 测定未吞边侧区序列时，通常需要从克隆中进行各种片段的亚克隆。
为避免这些步骤，我们采用扩展的PCR方法，使相邻边侧区域得以扩增。典型的PCR扩 增使用与互补链杂交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向内跨过两个引物之 间的区域。一个引物的DNA合成产物作为另一个引物的模板，进行DNA变性、引物退 火，DNA聚合酶管伸反应的多次重复性循环，可使引物规定区域的拷贝数成指数增 加。但用传统PCR方法得不到紧邻引物外侧的DNA序列，因为寡聚核苷酸所引导的既有 目的DNA又有引物外侧区的DNA合成在拷贝过程中只呈线性增长，这种线性增长是因 为，对于每种引物来讲，其不能引导DNA反向合成(3'-5').
几乎是同时，有三个实验室分别设计出一种方法，使PCR可以扩增边侧区域。该方法 (反向PCR)的基本点是用适当内切酶裂解核心区外分子，使这些酶切片段自身连接形 成环状分子，从而将边侧区域转化为内部区域。用与核心区末端同源的引物，但其 3'端趄向未知区域，可以进步用PCR扩增环中的未知区域，该方法如图1所示。
反向PCR程序
Ochman等[5]，Triglia等[6]和Silver、Keerikatte[7]的文章中详细地描述了反向 PCR的不同应用，下面是Ochman[1]等描述的方法概要。
用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下，首先 需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游 或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类 型决定的接点(例如，互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列，初试时 最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向 PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入 合适的酶切位点。
用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环[8]。在一些实验中，为产生对反向 PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环 化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理(钝化)。连接前，需用酚或热变性使内切 酶失活。在我们实验中，不必裂解环状分子核心区也可得到有效的PCR扩增。(这显然 不同于Silver和Keerikatter[7]的实验结果，他们报道在核心裂解使模板线性化后， PCR扩增率增加100倍，但Triglia[5]等则发现裂解环状分子与加热引起随机缺口效果 相同)。
聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部 分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。
反向PCR的应用
边侧区域的扩增
反向PCR的应用已经证明该方法可以避免不方便的克隆和亚克隆步骤，因此可解决大 量问题。我们最初用反向PCR扩增E.coli(Escherichiacoli)天然分离物中转位插入序 列ISL的边侧序列;Triglia[6]等将反向PCR用于编码疟原虫(Plasmodiumfalciparum) 主裂殖子表面抗原前体的基因，在实验中，他们用RsaⅠ酶裂解基因组DNA，连接，得 到的环再用HinfⅠ在内部位点酶切，然后进行扩增，得到预期的297bp大小的片段， 并用DNA直接测序进行鉴定。他们认为反向PCR由于具有从全长cDNA得到序列信息的优 点，将对步查现转录基因的5'端或3'端的边侧区域有用。
反向PCR的另一个应用是Silver和Keerikatte进行的[7]。他们将其应用于扩增拉于整 合在小鼠细胞中的外生原病毒DNA边侧的细胞DNA。除强调反向PCR在染色体“步查” (Walking)或“跳查”中的用途，他们还指出，该技术用于扩增特征性弱的序列，这 些序列在E.Coli或其他宿主载体系统中很骓或不能克隆。
末端特异探针的制备
我们已改进反向PCR方法以得到在酵母人工染色体（YACS）[1]中的插入载体接头处的 特异探针。YACs库建立于果蝇(Drosophilamelanogaster)OregonR种的高分子量DNA 上，有约平均大小170kb的插入。因为反向PCR可扩增果蝇插入子的特异末端，用YAC 载体任一臂上的一已知序列作核心区即可扩增，得到的DNA片段可用作探针检测所建 库中重叠和相邻的克隆序列[1]。
许多果蝇YAC染色体含有很大的插入区，可以与唾液腺多线染色体上几个相邻的主带 杂交。通过反各PCR人这些YAC克隆中产生末端牧场划1片段用于原位发交，也可以确 定插入DNA的方向。而且，许多YAC克隆含有中度或高度重复DNA序列，它们不能直接 用来探测文库以确定重叠克隆。图2为反向PCR产生的生物素标记的末端特异探针对果 蝇多线染色体的原位杂交。该探针含约1.3kb果蝇DNA，来自位于染色体2R染色体顶部 图中的一个120kb的YAC3'端。除了有助于确定具体YAC克隆的方向外，反向PCR产生的 末端特异DNA片段也克服了在含有重复DNA序列克隆的定位中的问题及制备毫克级特异 YAC探针用于染色体步查和杂交中的问题。
反向PCR产生的特异末端片段与黑腹果蝇多线染色体杂交。染色体2R顶端黑色区 域为从含果蝇基因组DNA的酵母人工染色体上进行反向PCR扩增的产物与染色体2R杂交 所至。
反向PCR的应用和局限
如Ochman等，Silver和Keerikatte所述，反向PCR在研究转座因子、反转录病及其他 能与基因组DNA整合或易位的DNA序列中有许多重要应用。这些应用包括序列的易位、 转座和基因融合，其中之一是已知序列，例如癌基因或免疫系统的基因组成。在所有 这些情况中，如已知序列插入未知序列或与未知序列并列，反向PCR可用于测定未知 边侧序列。反向PCR的主要优点是简单快速，可以研究许多独立克隆。其某些应用适 合于临床诊断。
目前反向PCR的局限之一是由未知边侧序列性质引起的，需用几种酶试验以选择产生 大小合适的片段的内切酶。另一局限是许多常用内切酶也在不适当位点裂解载体序 列。但一旦确定合适的内切酶，反向PCR方法是直接了当和可靠的。
大多数真核基因组含大量中度或高度重复序列，YAC或科斯粒中未知接点序列有时也 包括这些序列。通过反向PCR扩增得到的探针可与许多基因组序列杂交，但它们在用 于染色体的步查或跳查方面会受到限制，在这种情况下，需要进行亚克隆。
