PCR技术（十四）：反向PCR

描述一种大聚合酶链反应(PCR)应用的方法，使在已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR 增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。

PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向性，使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。 这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定边侧区域本身的上、下游序列。

引言

通常测定一个与已知序列相邻的DNA序列是必要的，例如位于编码DNA的上游和下游两侧的区域，转位因子的插入位点以及克隆于Lambda、科期粒或酵母人工染色体载体上 的DNA片段末段的未知序列的探针等。这种末端特异探针在Southern Blot或染色体步查(Chromosome walking)所需的噬菌斑杂交或克隆杂交中都十分有用。

要得到边侧序列的探针一般需要进行一系列费时、费力的工作，首先用内切酶裂解和用已知边侧序列的探针Southern杂交以确定大小适合于克隆的末端片段;这些片段还要经过凝胶分离、克隆，得到的物质再与已知边侧区域杂交以确定合适的克隆子。要测定未吞边侧区序列时，通常需要从克隆中进行各种片段的亚克隆。

为避免这些步骤，我们采用扩展的PCR方法，使相邻边侧区域得以扩增。典型的PCR扩增使用与互补链杂交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向内跨过两个引物之间的区域。

一个引物的DNA合成产物作为另一个引物的模板，进行DNA变性、引物退火，DNA聚合酶管伸反应的多次重复性循环可使引物规定区域的拷贝数成指数增加。

但用传统PCR方法得不到紧邻引物外侧的DNA序列，因为寡聚核苷酸所引导的既有目的DNA又有引物外侧区的DNA合成在拷贝过程中只呈线性增长，这种线性增长是因为，对于每种引物来讲，其不能引导DNA反向合成(3'-5')。

几乎是同时，有三个实验室分别设计出一种方法，使PCR可以扩增边侧区域。该方法 (反向PCR)的基本点是用适当内切酶裂解核心区外分子，使这些酶切片段自身连接形成环状分子，从而将边侧区域转化为内部区域。用与核心区末端同源的引物，但其3'端趄向未知区域，可以进步用PCR扩增环中的未知区域。

反向PCR程序

Ochman等，Triglia等[6]和Silver、Keerikatte[7]的文章中详细地描述了反向PCR的不同应用，下面是Ochman等描述的方法概要。

用传统的缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定，目前，PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端片段。

能裂解核心区的内切酶使反向PCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类 型决定的接点(例如，互补突头连接与钝头连接)。

对于扩增左翼或右翼序列，初试时 最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。

用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。在一些实验中，为产生对反向 PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶，但这样所产生的片段末端则不适于连接，环化前需用Klenow或噬菌体T4DNA聚合酶修理(钝化)。

连接前，需用酚或热变性使内切酶失活。在我们实验中，不必裂解环状分子核心区也可得到有效的PCR扩增。(这显然 不同于Silver和Keerikatter[7]的实验结果，他们报道在核心裂解使模板线性化后， PCR扩增率增加100倍，但Triglia[5]等则发现裂解环状分子与加热引起随机缺口效果相同)。

聚合酶链反应条件与经典所用的相同，例如，94℃-30秒变性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分钟，进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时，与核心区末端后部结合的扩增引物更为有用，它使测序引物扩增部分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近，减少了扩增引物的干扰。

边侧区域的扩增

反向PCR的应用已经证明该方法可以避免不方便的克隆和亚克隆步骤，因此可解决大量问题。我们最初用反向PCR扩增E.coli(Escherichiacoli)天然分离物中转位插入序列ISL的边侧序列；Triglia等将反向PCR用于编码疟原虫(Plasmodiumfalciparum) 主裂殖子表面抗原前体的基因，在实验中，他们用RsaⅠ酶裂解基因组DNA，连接，得 到的环再用HinfⅠ在内部位点酶切，然后进行扩增，得到预期的297bp大小的片段， 并用DNA直接测序进行鉴定。他们认为反向PCR由于具有从全长cDNA得到序列信息的优点，将对步查现转录基因的5'端或3'端的边侧区域有用。

反向PCR的另一个应用是Silver和Keerikatte进行的。他们将其应用于扩增拉于整 合在小鼠细胞中的外生原病毒DNA边侧的细胞DNA。除强调反向PCR在染色体“步查” (Walking)或“跳查”中的用途，他们还指出，该技术用于扩增特征性弱的序列，这 些序列在E.Coli或其他宿主载体系统中很骓或不能克隆。

末端特异探针的制备

我们已改进反向PCR方法以得到在酵母人工染色体（YACS）中的插入载体接头处的 特异探针。YACs库建立于果蝇(Drosophilamelanogaster)OregonR种的高分子量DNA 上，有约平均大小170kb的插入。因为反向PCR可扩增果蝇插入子的特异末端，用YAC 载体任一臂上的一已知序列作核心区即可扩增，得到的DNA片段可用作探针检测所建 库中重叠和相邻的克隆序列[1]。

许多果蝇YAC染色体含有很大的插入区，可以与唾液腺多线染色体上几个相邻的主带杂交。通过反各PCR人这些YAC克隆中产生末端牧场划1片段用于原位发交，也可以确定插入DNA的方向。而且，许多YAC克隆含有中度或高度重复DNA序列，它们不能直接 用来探测文库以确定重叠克隆。图2为反向PCR产生的生物素标记的末端特异探针对果 蝇多线染色体的原位杂交。该探针含约1.3kb果蝇DNA，来自位于染色体2R染色体顶部 图中的一个120kb的YAC3'端。除了有助于确定具体YAC克隆的方向外，反向PCR产生的 末端特异DNA片段也克服了在含有重复DNA序列克隆的定位中的问题及制备毫克级特异 YAC探针用于染色体步查和杂交中的问题。

反向PCR产生的特异末端片段与黑腹果蝇多线染色体杂交。染色体2R顶端黑色区 域为从含果蝇基因组DNA的酵母人工染色体上进行反向PCR扩增的产物与染色体2R杂交所至。

反向PCR的应用和局限

如Ochman等，Silver和Keerikatte所述，反向PCR在研究转座因子、反转录病及其他 能与基因组DNA整合或易位的DNA序列中有许多重要应用。这些应用包括序列的易位、 转座和基因融合，其中之一是已知序列，例如癌基因或免疫系统的基因组成。在所有 这些情况中，如已知序列插入未知序列或与未知序列并列，反向PCR可用于测定未知 边侧序列。反向PCR的主要优点是简单快速，可以研究许多独立克隆。其某些应用适 合于临床诊断。

目前反向PCR的局限之一是由未知边侧序列性质引起的，需用几种酶试验以选择产生 大小合适的片段的内切酶。另一局限是许多常用内切酶也在不适当位点裂解载体序列。但一旦确定合适的内切酶，反向PCR方法是直接了当和可靠的。

大多数真核基因组含大量中度或高度重复序列，YAC或科斯粒中未知接点序列有时也包括这些序列。通过反向PCR扩增得到的探针可与许多基因组序列杂交，但它们在用于染色体的步查或跳查方面会受到限制，在这种情况下，需要进行亚克隆。