颜宁团队 2021 首秀+ 2020 年度文章赏析，看大牛如何玩转结构生物学！
丁香学术
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2020 年结构生物学突飞猛进，取得了令人瞩目的成就！
疫情初期，面对新型的冠状病毒，结构生物学家们争先恐后的对病毒结构进行了深度解析，一系列的研究成果为后续的抗体检测、中和抗体、疫苗研发等提供了坚实的结构基础；
2020 年 10 月，Nature 「背靠背」发表文章，将人们利用冷冻电镜的观测精度扩展到了原子分辨率级别，高达 1.2 Å 的分辨率下，蛋白原子结构清晰可见，与电子密度图完美契合；
2020 年 12 月，由 Google 旗下 DeepMind 开发的 AI 系统 AlphaFold，在精确预测蛋白质的 3D 结构上取得突破性进展，被誉为半个世纪以来最重要的突破之一。
普林斯顿大学分子生物学系颜宁教授作为活跃在最前沿的结构生物学家，也是最高产的生物学家之一。2021 新年伊始，1 月 5 日颜宁团队与清华大学尹航团队即合作在 PNAS 发表最新的学术论文，借此机会，丁香学术梳理了近 1 年颜宁团队主要研究成果，来看看大牛如何玩转结构生物学的！
2020 年到今日，颜宁教授已发表 10 篇顶刊论文（2 篇 Nature, 2 篇 Cell, 4 篇 PNAS, 1 篇 Nature Communications, 1 篇 Angewandte Chemie），下面将以时间线来逐一介绍这些高水平文章。
图片来自：https://molbio.princeton.edu/publications
1. 开发新型制备单层石墨烯膜材料新方法
2020 年 1 月 14 日，颜宁团队在 PNAS 发表题为 High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy 的研究论文，该论文 开发了一种更方便简捷的方法来制造高质量的石墨烯冷冻 EM 网格用于单颗粒冷冻 EM 分析。
图片来自：PNAS
研究团队通过使用有机分子辅助转移方法将连续的单层石墨烯从其原始基板铜箔转移到多孔碳栅格上来制造石墨烯冷冻 EM 栅格。在转移过程中，通过使用一层薄的甲基丙烯酸甲酯（MMA）支撑石墨烯，该方法可以使悬浮的石墨烯非常高地覆盖孔区域（高达 99％单层石墨烯覆盖率），允许超过 70％的网格方格有效的数据采集，提高图像质量和蛋白质密度。
使用该石墨烯网格，实现了分子量小蛋白质的最高分辨率 2.6Å（用于抗生蛋白链菌素，质量为 52 kDa）。该方法只采用简单的工具，并且可针对特定的蛋白质定制 EM 网格。
2. 揭示人源胆固醇酰基转移酶 (ACAT1) 三维结构及催化机制
2020 年 5 月 13 日，颜宁及黄超兰团队在 Nature 在线发表题为 Structural basis for catalysis and substrate specificity of human ACAT1 的研究论文，该研究介绍了 人类 ACAT1 的冷冻电子显微镜结构。
胆固醇酰基转移酶 (ACATs) 催化酰基辅酶 A 的一个酰基基团转移到胆固醇上，生成胆固醇酯，这是胆固醇在细胞中储存和在血浆中运输的主要形式。ACATs 作为潜在的药物治疗目标，如动脉粥样硬化，阿尔茨海默症和癌症等，已获得广泛的关注。
ACAT1 结构显示每个 protomer 都由九个跨膜段组成，这些跨膜段包围了一个胞质通道和一个在预计的催化位点会聚的跨膜通道。结构指导的突变分析的证据表明，酰基辅酶 A 通过细胞质通道进入活性位点，而胆固醇可能从侧面通过跨膜通道进入。这一结构和生化特征有助于合理解释 ACAT1 对不饱和酰基链的偏好，并提供对 MBOAT 家族中酶催化机制的见解。
图片来自：Nature
3. 揭示人源二酰甘油酰基转移酶 (DGAT1) 三维结构及催化机制
同期，2020 年 5 月 13 日，颜宁及周鸣团队在 Nature 在线发表题为 Structure and mechanism of human diacylglycerol O-acyltransferase 1 的研究论文，该工作利用单颗粒冷冻电镜技术， 首次解析了分辨率为 3.1Å 人源 DGAT1 的同源二聚体结构，并结合酶活性实验，确定了酰基辅酶 A（acyl-CoA） 在 DGAT1 上的结合位点。
图片来自：Nature
DGAT1 可以同型二聚体或同型四聚体形式存在，两种形式具有相似的酶活性。DGAT1 的 N 末端与邻近的 protomer 相互作用，而这些相互作用是酶促活性所必需的。
本研究中报道了首个人源 DGAT1 同源二聚体结构以及其底物 acyl-CoA 的结合位点，对于针对 DGAT1 靶点抑制剂开发有重要指导作用。另外，DGAT1 的结构也将为 MBOATs 超家族中其他成员的结构及功能研究提供重要的信息。
4. 揭示 Nav 通道的结构和功能机制
NaChBac 是第一个被表征为电压门控的 Na+（Nav）通道，已经成为研究 Nav 通道结构与功能关系的原核原型。近二十年来，NaChBac 的结构解析尚无大的进展。
2020 年 6 月 8 日，颜宁团队在 PNAS 在线发表题为 Employing NaChBac for cryo-EM analysis of toxin action on voltage-gated Na+ channels in nanodisc 的研究论文， 该研究介绍在洗涤剂胶束和纳米圆盘中 NaChBac 的单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析。
在两种条件下，NaChBac 的构象与潜在灭活的 NavAb 的构象几乎相同。确定纳米光盘中 NaChBac 的结构使研究人员能够检查脂质双层中 Nav 通道的门控修饰剂毒素（GMT）。
为了研究哺乳动物 Nav 通道中的 GMT，该研究生成了一个嵌合体，其中 Nav1.7 的第二个电压感测域中 S3 和 S4 区段的细胞外片段替换了 NaChBac 中的相应序列。单独和与 HuwenToxin IV（HWTX-IV）配合使用的纳米盘嵌入嵌合体的 Cryo-EM 结构分别确定为 3.5Å 和 3.2Å 分辨率。
与 HWTX-IV 结合的人 Nav1.7 的结构相比，该结构的总分辨率为 3.2Å，毒素的局部分辨率已从约 6Å 提升到了约 4Å。此解决方案可实现毒素对接的可视化。因此，NaChBac 可以用作膜环境中 GMT 与 Nav 通道之间相互作用的结构研究的便捷替代品。
图片来自：PNAS
5. 首次解析 NPC1/2 复合物结构，揭示胆固醇分子「转运旅程」
溶酶体胆固醇的排出需要两种蛋白质 NPC1 和 NPC2，其缺陷是造成 C 型 Niemann-Pick 疾病的原因。
2020 年 6 月 15 日，颜宁及杨洪远团队在 Cell 在线发表题为 Structural Basis of Low-pH-Dependent Lysosomal Cholesterol Egress by NPC1 and NPC2 的研究论文， 该研究揭示了低 pH 依赖性胆固醇从 NPC2 传递到 NPC1 跨膜（TM）域的分子基础。
在 pH 8.0 时，在纳米光盘和去污剂中分别获得 3.6Å 和 3.0Å 分辨率的 NPC1 类似结构，揭示了连接 N 端结构域（NTD）和跨膜固醇传感结构域（SSD）的隧道结构；在 pH 5.5 时，NTD 表现出两个构象，表明胆固醇向隧道输送的运动。在通道的膜边界发现了一个假定的胆固醇分子，TM2 向 SSD 上的表面袋形成。最后，在 pH 5.5 时获得了分辨率为 4.0 的 NPC1-NPC2 复合物的结构，阐明了胆固醇从 NPC2 转移到 NPC1（NTD）的分子基础。
图片来自：Cell
6. 设计新型膜蛋白研究流程，助力膜蛋白结构研究
2020 年 7 月 17 日，颜宁团队在 PNAS 发表题为 Cryo-EM analysis of a membrane protein embedded in the liposome 的研究成果。本篇文章通过对蛋白质脂质体制备条件优化，石墨烯载网筛选及深度 2D 分类， 设计了一个利用冷冻电镜技术对于嵌入脂质体中高分辨膜蛋白结构分析的完整工作流程，为膜蛋白结构和功能的研究提供了思路。
本篇文章设计了一个利用冷冻电镜技术对于嵌入脂质体中高分辨膜蛋白结构分析的完整工作流程。该流程包含：蛋白质脂质体准备过程的优化（样品制备过程中的去垢剂，脂质体，脂质体分离等），选取高质量的石墨烯载网，及深度的 2D 分类（多步 2D 分类的方法除去不好的颗粒）。
总之，作者为我们接下来进行膜蛋白结构和功能的研究提供了很好的思路和解决方法。
图片来自：PNAS
7. 聚焦疟原虫糖转运蛋白，助力开发新型抗疟药物
2020 年 8 月 28 日，颜宁团队与清华大学尹航团队合作在 Cell 上在线发表题为 Structural Basis for Blocking Sugar Uptake into the Malaria Parasite Plasmodium falciparum（抑制恶性疟原虫糖摄入的结构基础）的重要研究成果。
该论文报道了 PfHT1 分别结合天然底物葡萄糖和一个已知的选择性与抑制效果都比较微弱的抑制剂 C3361 的两个结构。出乎意料，C3361 的结合导致了 PfHT1 巨大的构象变化，衍生出一个全新的空腔结构，可以用来作为靶点进行抑制剂的设计与优化。
在此发现的基础上，团队成员开发出了一系列具有更高亲和力的选择性抑制剂，在原虫抑制实验中确认可以有效杀死疟原虫，却对人源细胞无害，从而为开发新一代抗疟药物开辟了道路。
图片来自：Cell
8. 二氢吡啶化合物调控电压门控钙离子通道 Cav1.1 的机制
2020 年 10 月 30 日，颜宁团队在 Angewandte Chemie 上在线发表了 Structural Basis of the Modulation of the Voltage-Gated Calcium Ion Channel Cav1.1 by Dihydropyridine Compoundundefined。
1,4 - 二氢吡啶 (DHP) 是最常用的抗高血压药，通过抑制 L 型电压门控 Ca2+(Cav) 通道发挥作用。DHP 化合物表现出手性特异性的拮抗或激动作用。兔源 Cav1.1 与非手性药物硝苯地平结合的结构揭示了 DHP 药物的一般结合模式，但手性特异性的分子基础仍然未知。
该研究报告了纳米盘包埋 Cav1.1 在畅销药物氨氯地平（amlodipine）、DHP 拮抗剂 (R)-(+)-Bay K8644 和其激动剂 (S)-(-)-Bay K8644 冷冻电镜结构，分辨率为 2.9-3.4 Å，氨氯地平结合的结构揭示了该药高疗效的分子基础。
图片来自：Angewandte Chemie
9. 揭示人源 Ferroportin（铁转运蛋白）中离子转运和抑制的结构和机制
2020 年 11 月 10 日，颜宁及周鸣团队在 Nature Communication 在线发表题为 Structural basis of ion transport and inhibition in ferroportin 的研究论文， 该研究介绍了人类的 Ferroportin（铁转运蛋白）冷冻电子显微镜结构。
Ferroportin 是一种铁输出剂，对释放细胞铁进入循环至关重要。铁转运蛋白被一种肽类激素 hepcidin（铁调素）所抑制。在人类中，铁转运蛋白的突变会导致铁转运蛋白疾病，通常与巨噬细胞中铁的积累和缺铁性贫血的症状有关。
该研究解析了来自灵长类眼镜猴（TsFpn）的铁转运蛋白在存在和不存在铁调素的情况下的结构。TsFpn 由两个类似于蚌壳的域组成，该结构定义了两个金属离子结合位点，每个结构域有一个。两种结构都是朝外的构象，肝素在两个域之间结合并到达其中一个离子结合位点。
这些结果奠定了铁运素金属离子结合、转运和抑制的结构基础，为铁运素疾病的药理学干预中的靶向研究提供了蓝图。
图片来自：Nature Communications
10. PfHT1 抑制剂新型抗疟药物的研发
2021 年 1 月 5 日，清华大学药学院尹航团队与颜宁团队合作，共同通讯在 PNAS 在线发表题为 Orthosteric-allosteric dual inhibitors of PfHT1 as selective anti-malarial agents 的研究论文，该研究通过抑制恶性疟原虫中唯一的己糖转运蛋白 - 恶性疟原虫己糖转运蛋白 1（PfHT1），开发了一种「选择性饥饿」策略，提供了一种对抗多种药物疟原虫的方法。
图片来自：PNAS
该研究设计了小分子以同时阻断 PfHT1 的正构和变构口袋。通过广泛的结构 - 活性关系研究，TH-PF 系列被鉴定对多种血阶段恶性疟原虫具有有效的作用。
该系列化合物对红内期疟原虫各亚期都有良好的抑制效果，且与现有抗疟药物（双氢青蒿素）表现出不同的作用模式，这代表着一种新型抗疟药物的研发思路，从而为该系列抗疟药物的进一步开发奠定了基础。
正像颜宁老师所说，技术应该服务于探索。
结构生物学远不止单纯的分子的拼装，而是首重生物学的发现，是科学家理解生命 / 认识世界的一种手段。
新的一年，让我们一起去发现！
