蛋白质SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

【实验目的】

熟悉蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，掌握蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法，了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用范围。

【实验原理】

蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。当溶液pH值大于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动；反之则向负极移动，这种带电的颗粒在电场中泳动的现象称为电泳（electrophoresis）。不同的蛋白质由于等电点不同，在电场中的泳动速率也不同，因此应用电泳技术很容易实现对蛋白样本的分离与分析。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）是目前用于测定蛋白质亚基分子量的常规方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂N,N'-甲叉双丙烯酰胺在引发剂（过硫酸铵）和增速剂（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）的氧化-还原作用下聚合而成的。

凝胶的有效孔径与它的总浓度T％成反变关系，在高浓度时，凝胶孔径小，可以筛分分子量小的多肽；低浓度时，凝胶孔径大，则可筛分大分子蛋白质。工作时，凝胶由浓缩胶和分离胶两部分组成，浓缩胶浓度低、孔径大，较稀的样品经过大孔径凝胶的迁移作用可被浓缩至一极窄的区带，以提高样品中各组分在分离胶中的分辨率。

SDS是一种阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠。还原剂二硫苏糖醇 (dithiothreitol, DTT）或巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。

因此，在样本中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子将被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合,可形成带负电荷的蛋白质亚基-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异；然而，蛋白质亚基-SDS胶束的长轴长度与亚基分子量的大小成正比。

因此，当这种胶束在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率不再受蛋白质分子原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。

蛋白质SDS-PAGE常用于蛋白质分子量的测定，蛋白质纯度的分析，蛋白质浓度的检测，免疫印迹（Western Blot）的第一步，蛋白质修饰及免疫沉淀蛋白的鉴定等。

【器材与试剂】

1. 微型凝胶电泳装置 　（如：Bio-Rad Mini-Protein Ⅲ型电泳仪），电泳电源，100℃沸水浴装置，Eppendorf管，微量注射器，带盖塑料染色盒，摇床。

2． 制胶试剂　丙烯酰胺（电泳级），N，N'-甲叉双丙烯酰胺，Tris碱，SDS，TEMED，过硫酸铵，DTT或α-巯基乙醇，甘油，溴酚蓝，甘氨酸，盐酸。

3. 染色/脱色试剂　考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸

4. 储存液

（1）30％丙烯酰胺储存液：29.2g丙烯酰胺，0.8g双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，储存于棕色瓶中，4℃保存1个月左右。（注意：未聚合的丙烯酰胺有神经毒性，须在通风橱内小心操作）。

（2）4 ×分离胶缓冲液100ml：75ml 2mol/L Tris-HCL（pH8.8），4ml 10% SDS，21ml蒸馏水，可在4℃存放数月。

（3）4×浓缩胶缓冲液100ml：50ml 1mol/L Tris-HCL(pH6.8)，4ml 10% SDS，46ml 蒸馏水，可在4℃存放数月。

（4）10% 过硫酸铵，5ml（0.5g过硫酸铵, 加5ml蒸馏水, 新鲜配置），-20℃保存一个月左右。

（5）10% （w/v）SDS，10g SDS加蒸馏水100ml, 室温保存。

（6）10% TEMED 0.1ml TEMED , 加0.9 ml蒸馏水。

（7） 2×上样缓冲液（10ml）：0.6ml 1mol/L Tris-HCL (pH6.8)，4ml 50%的甘油，2ml 10% SDS， 2ml 1mol/L 二硫苏糖醇（DTT），1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。

（8） 5×电泳缓冲液 （1L）：15.1g Tris碱，72g甘氨酸，50ml 10%SDS 加蒸馏水至1L，pH 8.3。

（9）考马斯亮蓝染色液：1.0g考马斯亮蓝R-250，450ml甲醇，100ml冰醋酸，450ml蒸馏水定容至1000ml。

（10）考马斯亮蓝脱色液：100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml蒸馏水。

【实验方法与步骤】

1. 分离胶的制备

（1）凝胶中丙烯酰胺的百分比浓度（X％）与蛋白质的分辨范围

（2）分离胶的配方：

30％丙烯酰胺储存液、4 ×分离胶缓冲液、蒸馏水、10%过硫酸铵、TEMED

灌制分离胶。

（3）分离胶的灌制：

（1）按说明书组装好凝胶模具，对于Bio-Rad 微型凝胶系统，在上紧夹具之前，必须确保两块凝胶玻璃板和底部的封胶橡胶条紧密接触，避免漏胶。

（2）将30％丙烯酰胺储存液与4x分离胶缓冲液以及蒸馏水在一个小烧杯中混合。

（3）加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌混匀(凝胶会很快聚合，操作要迅速)。

（4）将凝胶溶液用吸管沿长玻板壁缓慢加入制胶模具中，避免产生气泡。凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm（距梳子齿约0.5cm），接着在分离胶溶液上轻轻覆盖约1cm高的蒸馏水以封胶。约30min后，若在分离胶与水层之间可见一个清晰的界面，表明凝胶已聚合。

3. 浓缩胶的配方　5%的浓缩胶4ml， 用于Mini-Protein Ⅲ 型电泳槽

4. 浓缩胶的灌制

（1）向一侧倾斜制胶模具，吸掉覆盖在分离胶上的水；将30％丙烯酰胺储存液与4x浓缩胶缓冲液及蒸馏水在小烧杯内混合，加入过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀。

（2）将浓缩胶溶液用吸管加至分离胶上面，直至前玻璃板的上缘。

（3）迅速将点样梳插入凝胶内，直至梳齿的底部与前玻璃板的上缘平齐。待凝胶聚合 (约30min) 后，小心拔出点样梳。

5. 预电泳　将1X电泳缓冲液加入内外电泳槽，使凝胶的上下端均能浸泡在电泳缓冲液内；接通电源，上槽为负极，下槽为正极，80V预电泳3～5min。

6. 样品制备/上样/电泳　将20?滋l蛋白质样品与20?滋l 2×上样缓冲液，在Eppendorf管中混合，100℃加热3～5min；离心 5～10s，用微量注射器或移液器将样品（弃沉淀）缓慢滴入凝胶梳孔中；继续低电压（80V）电泳至样品进入分离胶，再将电压调至150V，保持恒压电泳，直至染料迁移至凝胶的底部（对于两块6cm×8cm×0.75mm的凝胶，约需50min），电泳结束。

小心撬开玻璃板，凝胶便贴在其中一块板上；切去浓缩胶和某一胶角（作标记）。

7. 染色与脱色　将凝胶浸入考马斯亮蓝染色液中，置摇床上缓慢震荡30min以上（染色时间需根据凝胶厚度适当调整）。取出凝胶在水中漂洗数次，再加入考马斯亮蓝脱色液、震荡。凝胶脱色至大致看清条带约需1h，完全脱色则需更换脱色液2～3次，震荡达24h以上。

凝胶脱色后可通过扫描、摄录等方法进行蛋白质定量检测。

【注意事项】

1. 凝胶不聚合的可能原因

（1）试剂质量差，应使用电泳级别的试剂。

（2）过硫酸铵和TEMED的量不够或失活，可增加剂量或重配新鲜的储存液。

（3）凝胶聚合时温度太低，应以室温为宜。

2． 上样时，样品不能沉到加样孔底部，可能是上样缓冲液中甘油含量不足；或是加样孔底部留有聚合的丙烯酰胺。

3． 经过煮沸的样品虽然可以在-20℃保存数周，但若反复冻融会导致蛋白质的降解。从-20℃取出的样本，上样前应先升至室温，确保SDS沉淀溶解。

4． 注意避免电泳条带弯曲畸变：

①“微笑” 现象，可能是因为凝胶中间部分温度过高，降低电压便可得到改善.

②“皱眉”现象，常常是因为凝胶底部有气泡或聚合不均匀。

③“拖尾”、“纹理”现象，则多为样品溶解不佳，增加蛋白样品的溶解度并离心除去不溶性颗粒即可克服。

④“晕轮”效应（holo effect）多为加样过量所致。

5． 非特异性的染色主要是由于未溶解的染料的沉积而成，应将染料溶液过滤后再用。

6． 如果电泳后将对蛋白质进行定量检测，须特别注意：

已知和未知样品必须使用相同的溶剂系统、相同的浓度、相同的加样量，并在同一块凝胶上电泳和染色。

　思 考 题

1． 蛋白质的分辨范围为什么与凝胶中丙烯酰胺的浓度有关？

2． 如何克服SDS-PAGE中遇到的条带弯曲畸变现象？

3． 需要保持蛋白质中各抗原物质的天然构象时，SDS-PAGE