大鼠海马神经细胞钠通道电流的记录

【实验目的】

1． 了解膜片钳技术的基本原理及记录方法。

2． 观察记录大鼠海马神经细胞单通道钠电流及全细胞钠通道电流。

【实验原理】

钠通道在多种细胞尤其是在神经、肌肉等可兴奋细胞中广泛存在。钠电流（ⅠNa）是快反应细胞上最重要的除极离子流，与细胞的兴奋性密切相关。钠通道在膜电位-70～-65 mV开始激活，产生一迅速激活并迅速失活的内向电流，最大电流峰值在膜电位-40 ～-30 mV，反转电位为+30 mV左右。在参数设计上应使膜电位钳制在-80 mV以下，此时给予不同程度的去极化阶跃电压，则可得到钠电流，由于钠通道激活和失活均很快，属于快通道，因此，刺激脉冲波宽常为20～50 ms。当静息膜电位升至-50 mV左右，可使Na+通道完全失活，不能引起钠通道开放。为证实所测电流为钠电流，常借助于工具药，如细胞外液中河豚毒（TTX）或Ⅰ类抗心律失常药来选择性阻断钠通道。

【实验对象】

成年大鼠。

【试剂与器材】

1． 器材　膜片钳放大器、微电极拉制器、倒置显微镜、三维操纵器、电极抛光仪、玻璃微电极、恒温水浴箱、切片机、哺乳类动物手术器械、氧气瓶。

2． 试剂和药品　胰蛋白酶和河豚毒为美国Sigma公司产品、人工脑脊液、电极内液、普罗帕酮。 ①人工脑脊液成分（mmol/L）：NaCl  124，KCl 3.3，NaH2PO4 1.2， NaHCO3 26，CaCl2 1，MgSO4 5，HEPES 10，Glucose 10，TEA 10, 4-AP 1 ,pH 7.2～7.4。②电极内液成分（mmol/L）：CsF 140, EGTA 10, HEPES 10，TEA 10, pH 7.2～7.4。

【实验方法与步骤】

1． 海马神经细胞的急性分离方法

将大鼠以20%乌拉坦1g/kg（5ml/kg）麻醉后断头，立即取出脑组织并迅速置入低温人工脑脊液(0℃～4℃)中10～20ｓ，然后于大脑半球腹内侧分离出海马，将海马切成400μm的薄片，置于人工脑脊液内孵育30 min后，更换为含1g/L胰蛋白酶的人工脑脊液酶解40min。用人工脑脊液冲洗脑片3次后，再将脑片置于人工脑脊液内孵育待用，上述孵育和酶解过程中，溶液需保持在32℃并连续通以5%CO2+95%O2混合气。最后，将部分脑片移入盛有氧饱和的人工脑脊液的离心管内，先后用尖端经热处理的直径为400μm和150μm左右的吸管轻轻吹打，直至单个海马神经元分离；取上部细胞悬液，加入培养皿内，约20min后细胞贴壁，即可在倒置显微镜下观察细胞形态，并进行膜片钳记录。

2． 玻璃微电极的制作

用微电极拉制器将玻璃毛细管分两步拉制成尖端直径约为 lμm的微电极；为了提高封接的成功率，可将微电极尖端在显微镜下接近抛光仪的热源进行抛光。然后用注射针从电极尾部充灌电极内液到微电极中备用。

3． 仪器的连接  （见图22-13）

4． 高阻抗封接的形成

将分离的大鼠海马单个细胞置于倒置显微镜的浴槽中，待细胞贴壁后，在三维液压操纵器推进下，使内充电极内液的微电极尖端进入浴液。由膜片钳放大器向微电极发放一电压为 10mV、波宽为40 ms的方波脉冲信号，观察封接形成过程。当微电极尖端与细胞表面接触后，可见应答电流减小，再向微电极尖端施以负压，使应答电流进一步减小至零，则形成G欧姆封接。

5． 大鼠海马神经细胞单通道钠电流的记录

在微电极与细胞膜封接电阻达到G欧姆级后，即形成细胞贴附式记录模式，此时，如给予膜片一个保持电位-120 mV、指令电位-50 mV的刺激，即可以记录到海马神经细胞的单通道电流（图22-14）。

6．　大鼠海马神经细胞全细胞钠电流的记录

在记录到单通道电流后，可经微电极给予负压吸引或电脉冲击破电极尖端的膜片，使电极内液与细胞内液相通，则形成了全细胞记录模式，调节快电容补偿，抵消电容性尖峰，调节放大器的慢电容补偿和串联电阻补偿来抵消瞬态电流。在电压钳制模式下，给细胞以如下参数刺激：保持电位为-120 mV，指令电压-90～-25 mV，脉冲阶跃为 10 mV，刺激频率为 0.5 Hz，持续时间为 40 ms，即可引导出全细胞钠通道电流（图２２－１４）。如在浴液中给予河豚毒（TTX） 50μmol/L或给予I类抗心律失常药普罗帕酮 20 μmol／L，灌流 10 min后，再给细胞以上述刺激，可观察到钠电流幅度的变化。

【注意事项】

1． 在分离细胞时，注意调整胰蛋白酶用量和消化时间，防止过度消化造成细胞损害。

2． 选择贴壁良好、立体感强、折光性好、表面光滑的细胞进行实验。  

3． 微电极尖端抛光，将有利高阻抗封接的形成并提高实验成功率。

  　思 考 题

1． 何谓膜片钳技术？其基本原理如何？

2． 全细胞记录钠电流的参数是如何设置的？