肝脏药物代谢酶CYP450含量测定

【实验目的】 <o:p></o:p>

测定药物对肝脏CYP450药物代谢酶的诱导和抑制作用。 <o:p></o:p>

【实验原理】 <o:p></o:p>

药物的体内代谢过程可分为I相反应（分解代谢）及II相反应（合成代谢）。I相反应包括氧化、还原和水解反应，主要由细胞色素P450（CYP450）酶催化。CYP450酶主要分布在肝脏，故又称作肝药酶。CYP450酶的诱导和抑制具有重要的临床意义，可导致临床上的药物相互作用。苯巴比妥钠为CYP450酶的诱导剂，而放线菌素D为CYP450酶的抑制剂。本实验通过测定苯巴比妥钠和放线菌素D对肝脏CYP450酶含量的影响，介绍了肝药酶诱导剂及抑制剂的筛选方法之一。 <o:p></o:p>

CYP450酶含量的测定：CYP450为血红素蛋白，其还原型与CO结合后，在波长450nm处出现吸收峰，故可通过测定溶液的吸光度值，反映溶液中CYP450酶的含量。 <o:p></o:p>

【实验对象】 <o:p></o:p>

小鼠（昆明种），雌雄各半。 <o:p></o:p>

【试剂与器材】 <o:p></o:p>

0.75%苯巴比妥钠溶液，0.002%放线菌素D溶液，0.25mol/L蔗糖溶液，Tris-HCl缓冲液，连二亚硫酸钠，生理盐水，分光光度计，天平，低温离心机，制冰机，CO气瓶，玻璃匀浆器，漏斗，移液管，冰盒。 <o:p></o:p>

【实验方法与步骤】 <o:p></o:p>

1. 分组　先将小鼠逐一称重，按照体重由小到大（或由大到小）排序。根据简化随机原则将小鼠分为3组（甲、乙、丙），每组3只。 <o:p></o:p>

2. 腹腔注射给药　甲组为0.75%苯巴比妥钠溶液，乙组为0.002%放线菌素D溶液，丙组为生理盐水。每组小鼠均连续给药3天。 <o:p></o:p>

3. 制备肝匀浆　小鼠处死，取出肝脏，注意勿破坏胆囊。称重后，将肝组织置于玻璃匀浆器中，加入预冷后的0.25mol/L蔗糖液（0.5ml/100mg肝组织），冰浴下研磨至淡粉色匀浆。然后4摄氏度下10,000 g离心20 min后，留取上清液。 <o:p></o:p>

4. CYP450酶含量的测定　取离心后上清液1ml，加入预冷后的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液9ml，充分混匀。冰浴下通CO气，1~2气泡/s，通气2min。将通气完毕的溶液分为两半，分别置于两个试管中：其一作为测定吸光度时的参照杯，另一加入连二亚硫酸钠5mg，充分混匀，即为待测样品杯。测定并记录样品杯在450nm和490nm波长下的吸光度值（表23-4）。 <o:p></o:p>

5. 计算CYP450酶含量 <o:p></o:p>

根据公式A = E·C·L，其中 <o:p></o:p>

A：吸光度 <o:p></o:p>

E：490nm到450nm波长的示差光谱消光系数，本实验中E = 104L/cm·mmol <o:p></o:p>

C：CYP450浓度 <o:p></o:p>

L：比色杯厚度（光路长度），本实验中比色杯为1cm <o:p></o:p>

因此，得到CYP450（nmol/g肝脏）= [(A450 - A490) / E·L]×50000 <o:p></o:p>

6. CYP450酶的诱导和抑制 <o:p></o:p>

（1） CYP P450升高百分率： <o:p></o:p>

[(苯巴比妥组-生理盐水对照组) /生理盐水对照组]×100% <o:p></o:p>

（2） CYP P450降低百分率： <o:p></o:p>

[(生理盐水对照组-放线菌素D组) /生理盐水对照组]×100% <o:p></o:p>

【注意事项】 <o:p></o:p>

1. 本实验制备肝匀浆过程均需于冰上操作完成，所使用的溶液均需预先置于冰中预冷，以避免操作过程中造成的CYP450酶损失和破坏。 <o:p></o:p>

2. 取出肝脏过程中，注意不要破坏胆囊，以避免胆红素对CYP450血红素蛋白测定的影响和干扰。 <o:p></o:p>

3. CYP450（nmol/g肝脏）= [(A450 - A490) / E·L]×50000的计算公式，其中50000为本实验制备肝匀浆过程中的稀释倍数。 <o:p></o:p>

4. 测定肝匀浆中CYP450酶含量为简单、粗略的测定方法。肝脏CYP450酶主要存在于肝细胞的滑面内质网上，故可采用超速离心法提取肝微粒体后，测定肝微粒体的CYP450含量。提取肝微粒体后亦可进一步与CYP450酶底物探药共孵育，从而测定CYP450酶对底物药物的代谢活性。提取肝微粒体方法简述如下：将肝匀浆离心后得到的上清液，4°C下105, 000 g离心60 min，留取离心后的沉淀，加入肝微粒体重悬液（0.25 M蔗糖-0.1 M磷酸钾缓冲液，1 mM EDTA，pH 7.4，1 ml/g肝脏）重悬，-80°C储存待用。 <o:p></o:p>

5. 本实验中CYP450酶含量的单位为nmol/g肝脏。若提取肝微粒体后，可通过测定肝微粒体的蛋白浓度（如Bradford法），求得单位蛋白浓度的CYP450酶含量。 <o:p></o:p>

<o:p> </o:p>　思 考 题 <o:p></o:p>

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1. 请举例说明CYP450酶的诱导或抑制具有哪些临床意义？ <o:p></o:p>

2. 试述CYP450诱导剂及抑制剂的可能作用机制？ <o:p></o:p>