神经退行性疾病蛋白宝典

1. 将 40μL 的 PFF 移入微量离心管中（最好是螺帽管）。2. 最大速度离心 60 分钟。3. 小心将上清液 (40μL) 转移到新管中。添加 10μL 的 5X Laemmli 缓冲液并标记为「上清液」。4. 将沉淀悬浮于 40μL PBS 中，再次最大速度离心 30 分钟。保存上清液并标记为 「洗涤」 。5. 将沉淀物悬浮在 40μL PBS 中并标记为 「沉淀物」 ，向该部分添加 1

大鼠蛋白注射步骤2 uL PFFs 或者单体 (阴性对照) 通过以下两个脑顶叶区的位置注射（每个注射位点 2uL）:AP + 1.6, ML + 2.4, DV - 4.2 从头骨AP - 1.4, ML + 0.2, DV - 2.8 从头骨30 天后, 用生理盐水灌注大鼠，然后将大鼠脑由冠状平面切开，将中脑与前脑分开。之后两部分都用 4% PFA 固定 48 小时.DAB 操作步骤第一天: (

硫黄素 T (Thioflavin T) 是一种荧光染料，可以和富含 β 折叠的结构结合，例如 α-突触核蛋白原纤维。一旦结合，硫黄素T 的发射光谱就会发生红移 ，并且荧光强度会增强，这是一个很好的用来检测原纤维形成的测试。以下是用 α-突触核蛋白前体原纤维和单体做的硫黄素T 检测的操作指南。

储存条件：单体, 未经超声处理的原纤维和纤丝: -80ºC; 保质期一年以上超声处理过的原纤维:-80ºC; 8 周冻融循环：最多 2 次冻融循环解冻条件：原纤维和纤丝: 37ºC单体: 置于冰上或 4ºC储存条件 (解冻的蛋白)：原纤维和纤丝: 室温. 不要将原纤维和纤丝保存在冰上或者 4ºC; 原纤维和纤丝在 4ºC 下不稳定并会很快降解. 原纤维和纤丝在室温下稳定，在准备实验时可以放在试验台

1. 解冻样品，样品浓度 1mg/mL。2. 将 10ul 样品加到碳膜网格上，1 分钟后用滤纸去除多余的液体。3. 加 10μl dH2O 于网格上，用滤纸去除多余的液体.4. 将 10ul 的 2% 乙酸双氧铀涂到网格上，30 秒后用滤纸去除多余的液体。5. 将另外 10ul 的 2% 乙酸双氧铀涂到网格上，1 分钟后用滤纸去除多余的液体。6. 让网格风干几分钟，然后将其存放在网格盒中。7.

此方法描述了一般AFM 样品制备和成像。具体参数可能因成像的蛋白质样本及其缓冲液成分而异。1. 1-5mg/mL 的蛋白质样品在过滤消毒的 dH2O 的中稀释 1/10 至 1/100 然后将 20uL 滴到新鲜切割的云母上（12mm，V1）。样品在室温下孵育 10-20 分钟。注：有些样品不容易粘在云母上；在这种情况下，用 0.1% 聚-L-赖氨酸预处理新鲜切割的云母，用过滤消毒的 dH2O 洗

超声前后准备 PFF 的步骤：1. 收到原纤维后，立即将它们储存在 -80℃。2. 提前计划好需要尝试的超声处理设置和原纤维的量以便实验顺利进行。3. 37℃ 下解冻超声实验所需的原纤维的量。4. 分装到多个超声管中，并按之前计划好的在不同的时间和设置下对它们进行超声处理。5. 通过电镜（EM） 查看上述经过超声处理的样品，寻找纤维尺寸分布为 ~50nm 的样品，记录为最佳超声处理设置。6. 解冻

储存条件：单体, 寡聚体, 和未经超声处理的原纤维和纤丝: -80ºC; 保质期一年以上超声处理过的原纤维: -80ºC; 8 周冻融循环：最多 2 次冻融循环解冻条件：原纤维, 寡聚体, 和纤丝: 37ºC单体: 置于冰上或 4ºC储存条件 (解冻的蛋白)：原纤维, 寡聚体, 和纤丝: 室温. 不要将原纤维保存在冰上或者 4ºC; 原纤维和纤丝在 4ºC 下不稳定并会很快降解. 原纤维, 寡聚体

1.在蒸馏水中制备 1mM 的硫黄素 T 储备液 (需是新鲜制备并用 2µm 注射式过滤器过滤)。2.然后用 PBS pH7.4 将每个孔中的硫黄素 T 储备液稀释至最终浓度为 25µM (每孔容量 = 100µL)。3.向每个孔中加入 10uM 肝素。4.将分装小份的 tau 蛋白在使用前于 37℃ 下进行解冻。5.将原纤维或单体 (或两者都有) 加入到合适的实验孔中. 用移液器上下吸放混合孔中

大鼠侧脑室注入特异性胆碱能毒剂模型是为侧脑室注射胆碱毒素 AF64A（ethylcholine mustard aziridium ion）特异性地损毁大鼠隔复合体内胆碱能神经元，制备 AD 模型。

大鼠侧脑室注入 β-淀粉样蛋白（Aβ）模型是将β-淀粉样蛋白不同的片段 Aβ1-42 或 Aβ1-40 注入脑室或海马等部位，大鼠出现学习和记忆功能损害，海马神经元坏死或缺失凋亡相关基因表达增加。

Parkinson 病模型的构建是利用神经毒剂 6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）破坏黑质的多巴胺神经元，6-羟多巴胺是多巴胺的羟基化衍生物，其化学结构与多巴胺 DA 类似，因此能够同 DA 竞争摄取位点，当 6-羟多巴胺被摄入细胞内能够被氧化分解产生活性氧及氧自由基，或直接引起线粒体功能障碍，导致神经元死亡造成 Parkinson 病模型。Hypothetical

灵长类动物 Parkinson 病模型主要是对动物颈总动脉注射 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP），其本身没有神经毒性，诱发 Parkinson 病的机制是 MPTP 能够穿过血脑屏障，进入脑中作用于神经胶质细胞及 5-羟色胺神经元，经单胺氧化酶 B 产生甲基苯基吡啶离子 MPP+，MPP+能够抑制线粒体呼吸功能，产生氧自由基从而损伤神经元，细胞数量减少造成灵长类动物 Par

​​α-突触核蛋白（SNCA）是最早发现与帕金森病（PD）存在关联的基因之一。在帕金森病中多巴胺能神经元不断受损，神经元内聚集了主要由 α-突触核蛋白构成的路易小体，最终导致了 PD 的临床持续病变。基因转染动物模型是向动物注射编码 α-synuclein 的重组腺病毒载体，单纯过表达 α-synuclein 并不能百分百制备成功的帕金森动物模型，只能作为可行模型的一种。本方法重点在于展示脑立体定

大鼠部分简单性癫痫模型是通过电极刺激产生癫痫波及癫痫症状。

利用电刺激大鼠海马区建立复杂部分性癫痫动物模型。

急性癫痫模型常为单次处理即可诱发癫痫的一次急性发作模型，包括最大电休克（pentylenetetrazol, PTZ）癫痫模型和戊四唑（pentylenetetrazol, PTZ）癫痫模型。其中最大电休克癫痫模型的构建是在动物两耳或眼球部位放性电极，以强电流通过电极对脑部进行短时间刺激，使动物产生双后肢强直性惊厥。

大鼠失神动物模型制备是对大鼠腹腔注射 γ-丁内酯（GBL），引起棘波和 4~6Hz 的棘波发放及失神样行为。由于 γ-羟基丁酸（GHB）是伽马氨基丁酸（GABA）的代谢产物，也是 GABAB 的受体阻断剂，是哺乳动物脑内的一种内源性神经递质，当它被注入动物静脉或腹腔时可以进入血脑屏障导致癫痫失神。而 GBL 是 GHB 的前体物质，进入体内后可被酶很快催化成 GHB，进而诱发失神样行为。

癫痫 (epilepsy) 是最常见的神经系统疾病之一。其特征是反复性惊厥发作，伴随不同的临床和脑电图表现。机理：乙酰胆碱 (ACh) 在癫痫发生中发挥着重要作用，ACh 受体激动剂匹罗卡品 (Pilocarpine) 全身给药能够引起癫痫发作；氯化锂可以有效提高机体对 Pilocarpine 的敏感性，即 Pilocarpine 的小剂量即可诱导发病，显著降低因 Pilocarpine 毒性作用

IL-1与小鼠胸腺细胞共同培养时，IL-1可刺激小鼠胸腺细胞增殖。进一步通过3H-TdR掺入法或染料摄入法判定小鼠胸腺细胞增殖量，推定IL-1的生物学活性。通过检测IL-1的生物学活性，可了解单核-巨噬细胞等的功能。