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利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合，已广泛应用于分子生物学（1）证实两种蛋白可能有相互作用（2）寻找能与已知蛋白发生相互作用的未知蛋白。

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GST 融合蛋白沉降实验

GST 沉降实验与 far western(方案 2) 相比有—个优点：探针蛋白是在更自然的环境下与可能的搭档蛋白孵育，因而增强了相互作用的有效性。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

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GST-pulldown操作流程

于-20℃或者4℃。（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用）1、原核融合蛋白A的获得（1）将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21（DE3）菌株（2）挑取单个克隆到含有5mlLB（+100ug/mlAmp）的10ml试管里，37℃培养过夜（3）将培养菌液转移到含有500ml LB（+100ug/mlAmp）的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10

操作方法所属实验：GST-pulldown 操作流程

GST 共结合纯化法

，从体外转录混合物中除去不溶性蛋白质聚合体。将 200μl 上清液（含标记实验蛋白和提取物）转移到一个洁净的试管中。6. 在另外一支含 200 μl 步骤 3 获得的上清液加入 20 μl 与琼脂糖颗粒结合的 GST 或 GST 融合蛋白（诱饵蛋白）并充分混匀。每个反应需要 2~5 μg GST 诱饵蛋白融合体。在每个反应中最好加入约 20 μl 琼脂糖颗粒以便在洗涤时可见到琼脂糖颗粒的沉淀。然而，如果 20 μl 琼脂糖颗粒结合的蛋白质超过 2~5 μg，即可补加未结合谷胱甘肽的琼脂糖颗粒提供必要

操作方法所属实验：GST 融合蛋白的亲和纯化实验

问GST pulldown结果求分析

土井挞克树

可能是c蛋白与体系中的酶反应，降解了A蛋白

实验问答4 回答407 围观

问GST标签的pulldown实验洗不干净怎么办

土井挞克树

用流动的蒸馏水进行冲洗，冲洗3-5次

实验问答4 回答707 围观

【求助】GST-pulldown 求助

做一个定量。纯化GST融合蛋白时，有些容易降解的蛋白质会出现电泳时有类似GST分子量的降解条带出现。山明水秀lxm 请问GST pulldown的柱子从哪里买到的，具体叫什么柱子呢，谢谢 xiaohuilang 上样量太大造成的本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming

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GST-pulldown操作流程

实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。试剂： NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton

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GST 融合蛋白的亲和纯化实验

本实验介绍了应用与谷胱甘肽-S-转移酶融合的蛋白质（GST 融合蛋白）来亲和纯化其他蛋白质，又称 GST 共结合纯化方法。这种共结合技术可用来补充评估蛋白质-蛋白质相互作用的其他方法：体外检测方法，如电泳迁移率变动分析（EM- SA）或免疫共沉淀；或体内检测方法，如双杂交相互作用阱和以泛素为基础的脱落蛋白感应器。来源《精编分子生物学实验指南（第五版）》

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GST pull-down 分析

蛋白质-蛋白质相互作用在诸如生物催化、转运、信号传导、免疫、细胞调控等多种生命过程起着重要的作用，因此对这种作用的研究对于了解生命活动规律具有深远意义。GST pull-down 分析主要用于蛋白质-蛋白质相互作用研究。

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备择用GST融合蛋白

1. 按照蛋白 A/G-琼脂糖浆所述的方式准备两份样本（见「用蛋白A/G-琼脂糖」步骤 1），不加抗体。2. 4℃ 下最大速度离心 10 min，沉淀非特异性聚集。转移上清到新的离心管中。3. 加 30 μl 谷胱甘肽-琼脂糖或者谷胱甘肽-琼脂糖浆（25～30 μl 珠子体积）。确保在加到样本中之前琼脂糖浆均匀悬浮。4. 旋转样本，沉淀然后洗谷胱甘肽-琼脂糖或者谷胱甘肽-琼脂糖浆，并且进行SDS- PAGE电泳和免疫印迹分析（见「用蛋白A/G-琼脂糖」步骤 5～10）。

操作方法所属实验：蛋白共沉淀检测实验

备择方案含 GST 标签

的 GST 洗脱缓冲液上柱。调至最大流速为5 ml/min每ml琼脂糖珠。让柱中液体流尽，分别收集洗脱液。可选择加入 150 mmol/L 的 NaCl、5 mmol/L CaCl2（或对于有些蛋白质为 5 mmol/L MgCl2）和 0.1% 2-巯基乙醇，这对某些蛋白质的可溶性是需要的。6. 将自由的谷胱甘肽在 100 倍体积的 50 mmol/L Tris · Cl（pH 8.0），4°C透析 >4 h。2 h后更换透析液。7. 每毫克含有凝血酶酶切位点的纯化 GST 或 6 × His 融合

操作方法所属实验：含有多聚组氨酸标签重组蛋白纯化实验

问我做了几轮gst pulldown 拉不出来蛋白。可能有哪些原因呀

土井挞克树

1. 选取的细胞中互作蛋白表达量很低；2. 样品中含有的非特异蛋白过多3. 样品中没有相互作用的蛋白质；4.样品中蛋白质浓度过低，肉眼难以观测到差异条带；

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问pulldown，IP实验

Dr_劉医生

免疫共沉淀的常见问题，建议先用特异性抗体试试，如果不能沉淀吸附的诱饵蛋白的话；可以给诱饵蛋白加上标签（比如，Myc、HA、Flag等），然后利用标签抗体沉淀蛋白。

实验问答2 回答793 围观

GST-pulldown操作流程

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大家都在做的GST pull-down实验

一、GST pull-down 基本知识1. GST pull-down 概念GST pull-down：是利用重组技术将探针蛋白与 GST 谷胱苷肽巯基转移酶融合，融合蛋白通过 GST 与固相化在球珠上的 GSH 谷胱甘肽结合。从而分离出能与融合蛋白相互作用的蛋白的技术。2. GST pull-down 研究对象二、GST pull-down 原理1. GST pull-down 结合原理2. GST pull-down 分离原理三、GST pull-down 流程1. 蛋白的抽提与纯化：①

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用 GST 融合蛋白检测蛋白质-蛋白质相互作用实验

GST 融合蛋白作为在细菌中表达的重组蛋白，从它们被介绍以来，已用于成千上万个研究项目中（Smith and johnson 1988)。它们常常被用于制备抗体，这些抗体可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用以及分析生化反应。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔。

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含有多聚组氨酸标签重组蛋白纯化实验

在本方案中，用重组病毒储液感染 Sf 9 细胞，在感染后 2～3 天分析。分析方案依赖于表达蛋白的天然特性。本方案仅提供一些建议步骤，但不可能包括全部。根据表达蛋白的不同特性和已有的检测试剂，筛选步骤可做相应的改变。内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》

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GST pull-down 分析

操作方法所属实验： GST pull-down 分析

GST 融合蛋白沉降技术检测蛋白质

/L Tris-Cl(pH8.0) 中的还原型谷胱甘肽（20 mmol/L)可选，请见步骤 8。2xSDS-PAGE 加样缓冲液凝胶SDS 聚丙烯酰胺凝胶关于 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的详情请见附录 8。专用设备沸水浴翻转祥品旋转仪谷胱甘肽琼脂糖球珠在裂解缓冲液中制成 50% 悬液。探针GST 蛋白带有“诱饵”或探针序列的 GST 融合蛋白按第 15 章方案 1 描述的方法构建。细胞和组织细胞裂解液，其中蛋白质 35S 用标记根据实验目的和所需检测方法，可用非标记的细胞裂解液。进一步的详情，请见

操作方法所属实验：GST 融合蛋白沉降实验