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大家都在做的GST pull-down实验

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GST pull-down 基本知识

1. GST pull-down 概念

GST pull-down:是利用重组技术将探针蛋白与 GST 谷胱苷肽巯基转移酶融合,融合蛋白通过 GST 与固相化在球珠上的 GSH 谷胱甘肽结合。从而分离出能与融合蛋白相互作用的蛋白的技术。

2. GST pull-down 研究对象

二、GST pull-down 原理

1. GST pull-down 结合原理

2. GST pull-down 分离原理

三、GST pull-down 流程

1. 蛋白的抽提与纯化:

原核表达蛋白纯化

② 真核表达蛋白抽提

2. 体系孵育与 pull-down

3. 考染检测与 WB 验证

四、GST pull-down 结果

1. GST pull-down 结果分析

① 考马斯亮蓝检测

② Western blot 验证

五、GST pull-down 拓展

1. GST pull-down 与 Co-IP 区别

① GST pull-down

② Co-IP

GST pull-down 与 Co-IP 区别:

GST pull-down 是原核纯化蛋白与真核蛋白在试管内发生生化反应互作的结果,只要互作蛋白间具有相互结合的结构域基础即可实验证明;

Co-IP 实验是细胞内高表达目的蛋白,并通过 IgG 球珠-抗体-蛋白复合物体系,分离出互作的蛋白复合物,是细胞内的体内反应结合。

2. GST pull-down 实验优点

① 可验证蛋白质-蛋白质之间的直接互作。

② GSH 谷胱甘肽偶联球珠亲和力强,洗脱纯度高。

3. GST pull-down 实验缺点

① 验证互作是在试管中进行的生化反应,不能够完全反应细胞内蛋白真实互作状态。

② 融合表达的 GST 标签,肽链较长,可能会改变原目的蛋白的原有的折叠结构。

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