合作专家 | 魏冉硕士
生物工程 浙江工业大学
审核专家 | 聂壹峰博士
纳米生物医学 中国科学院大学
简介
RNA 与蛋白质相互作用是细胞生理过程中的重要步骤，其中 RNA pull-down 实验用于研究 RNA 分子与蛋白质之间的相互作用关系。
该方法利用特定标记的 RNA 探针（biotinylated RNA）结合目标蛋白质，形成 RNA-蛋白质复合物，并通过亲和纯化形式富集出 RNA 与蛋白质复合物，洗脱实验后可以通过 Western blot 或质谱等技术鉴定 RNA 与蛋白质的结合情况。
原理
RNA pull-down 实验基于 RNA 与蛋白质的特异性互相识别和结合，通过连接生物素分子的 RNA 寡核苷酸可以特异性地结合目标蛋白质。富集 RNA 与蛋白质之间的相互作用复合物后，可通过 Western blot 或质谱等技术进一步研究 RNA 与蛋白质的结合情况。
用途
RNA pull-down 实验可以用于研究 RNA 与蛋白质之间的相互作用。其重要应用包括鉴定 RNA 与蛋白质复合物中的成员、筛选 RNA 结合蛋白质的靶标，以及研究 RNA 参与的基因表达调控机制等。
材料与仪器
① biotinylated RNA 探针
② Streptavidin agarose 琼脂糖
③ 10× lysis 缓冲液
④ 1M DTT
⑤ Protease inhibitor
⑥ WB buffer
⑦ 目标蛋白质抗体
步骤
RNA pull-down 实验的操作步骤如下：
1、试剂与仪器准备：
标记用试剂：生物素标记的 RNA 探针；
结合用试剂：磁性珠（如 Streptavidin-beads）；
洗涤缓冲液：1×PBS，0.1% NP-40；
仪器：磁性分离架，洗脱操作用热块或水浴，冰箱、低温离心机等。
2、生物素标记 RNA 探针的合成：
根据目标 RNA 序列设计和合成相应的探针，同时在 5' 端加入生物素标记。由于生物素与亲和素的结合非常特异，因此可以将标记过的探针与磁性珠有效结合。
3、样品处理：
A. 提取所需的细胞、组织或生物样品的总蛋白，将提取过程中可能损坏蛋白质结构的试剂浓度降到最低；
B. 预处理细胞提取物，以去除可能与磁珠竞争结合的生物素化成分。在预处理过程中，建议使用相同体积的磁珠平衡它们。
4、RNA 探针与磁性珠的结合：
A. 用预处理过的细胞提取物与生物素化 RNA 探针孵育至少 30 分钟，以使它们充分结合；
B. 加入前处理好的磁性珠与生物素标记的 RNA 探针结合，孵育至少 30 分钟，过程中保持在 4 ℃ 并轻度摇晃。
5、洗涤与洗脱步骤：
A. 在磁性分离架上进行几次洗涤，去除非特异性结合，建议至少洗涤 4~5 次；
B. 加入洗脱缓冲液，将结合的目标蛋白质与 RNA 探针从磁性珠上析出；
可选：使用酚/氯仿提取和乙醇沉淀的方法，对洗脱液中的 RNA 进行回收和纯化。
注意事项
1. 确保所有实验步骤和使用的试剂在无 RNase 的环境下进行。
2. 尽可能避免气泡的产生，因为它们可能干扰实验结果。
3. 在实验过程中及时对磁性珠进行分离，以提高分离效果。
4. 存放 RNA 探针的试管应先预先干燥，以避免 RNA 探针粘在试管壁上。
5. 对于低丰度的 RNA 或蛋白质，可以增加探针的用量或延长孵育时间以提高检测效果。
6. 设计合适的实验对照，以评估结合的特异性和实验的可靠性。
7. 遵循生物安全规定，对废弃物进行正确处理。
常见问题
1. 如何制备高纯度的细胞裂解液？
答：制备过程和材料需遵循标准实验室操作。含有 Protease inhibitor 和 1M DTT 的 10 × lysis 缓冲液可以有效地保证细胞蛋白裂解的高纯度，此外，细胞裂解过程中，需要在低温下（如冰袋）进行以避免蛋白质降解。
2. 如何优化实验操作条件？
答：可以尝试调节孵化时间和温度，将较高的背景噪音降至最低。
3. 如何避免蛋白质污染？
答：操作前先进行灭菌，操作完毕后也应该清洗所有设备和试剂，防止外源性蛋白质的污染。
来源：丁香实验
