合作专家 | 魏冉硕士
生物工程 浙江工业大学
审核专家 | 聂壹峰博士
纳米生物医学 中国科学院大学
简介
DNA Pull Down 也称为 DNA 亲和层析，是一种识别并分析 DNA 结合蛋白的方法。
原理
基于 DNA 的特异性配对和 DNA 结合蛋白的亲和性，将生物素标记的 DNA 片段结合在链霉亲和素磁珠上，与细胞核蛋白孵育，纯化出与 DNA 片段相互作用的蛋白，洗涤洗脱得到蛋白产物，用 western blot 或质谱方法对产物蛋白进行检测分析。
用途
纯化 DNA 结合蛋白、鉴定蛋白-核酸相互作用、筛选激动剂或抑制剂以及研究蛋白质结构和功能等。
材料与仪器
海藻酸琼脂糖（Agarose），目标 DNA 序列，磷酸盐缓冲盐（PBS），pH=7.2-7.4，固定化蛋白（如 GST-tagged protein），宿主细胞（如 E. coli）
步骤
1、试剂与仪器准备：
标记用试剂：干净、无生物素化标记的目标 DNA 片段
结合用试剂：亲和素磁性珠以及与目标 DNA 相对应的特异性蛋白探针
洗涤缓冲液：1×PBS，0.1% NP-40
仪器：磁性分离架，洗脱操作用热块或水浴，冰箱、低温离心机等
2、分子探针制备：
根据目标 DNA 序列，合成没有生物素标记的探针，并确定对应的特异性蛋白探针。此蛋白探针可以是 DNA 结合蛋白或其他与目标 DNA 片段有特异性结合的蛋白质。
3、样品处理：
获取所需的细胞、组织或生物样品的细胞裂解物；预处理细胞提取物，以去除可能与磁珠竞争结合的生物素化成分。在预处理过程中，建议使用相同体积的磁珠平衡它们。
4、DNA 片段与目标蛋白结合：
将目标 DNA 片段与它们对应的蛋白质探针混合，并在 4 ℃ 孵育至少 1 小时（实际的孵育时间可以根据研究需要进行调整），以便蛋白质与 DNA 片段形成稳定的复合物。
5、蛋白-DNA 复合物富集：
在亲和素磁性珠中加入蛋白-DNA 复合物，将孵育至少 30 分钟，以确保蛋白-DNA 复合物与磁性珠结合在一起。期间保持在 4 ℃ 并轻度摇晃；在磁性分离架上进行几次洗涤，去除非特异性结合，建议至少洗涤 4~5 次。
6、DNA 片段的洗脱与分析：
加入洗脱缓冲液或热水，用热块或水浴加热以将结合的目标蛋白质与 DNA 片段从磁性珠上析出；分析 DNA 片段含量的变化，例如通过 qPCR、凝胶电泳或质谱技术，验证实验效果。
注意事项
1. 确保所有实验步骤和使用的试剂在无 DNase 的环境下进行。
2. 尽可能避免气泡的产生，因为它们可能干扰实验结果。
3. 根据实验需要调整孵育时间，以便获得有效结合。
4. 对于低丰度的 DNA 或蛋白质，可以考虑增加探针的用量或延长孵育时间以提高检测效果。
5. 设计合适的实验对照，以评估结合的特异性和实验可靠性。
6. 遵循生物安全规定，对废弃物进行正确处理。
常见问题
1. 如何确定实验使用的探针 DNA 序列？
序列通常是基于以往发表的研究、文献或者课题组前期实验筛选出 DNA 序列。
2. 如何确定实验的浓度和 pH 值？
参考文献，课题组经验，及预实验摸索。
3. 如何解决背景问题？
去除未结合的探针，尽量清洗完全提取的蛋白质，western blot 检测蛋白时尽量选择特异性高的抗体，一抗及二抗洗涤时间要充分。
来源：丁香实验
