GST-pulldown操作流程  

利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

GST-pulldown主要包括以下三个部分：①利用基因重组技术构建带有GST标签的原核表达载体；②通过原核表达系统表达带有GST标签的融合蛋白；③利用GST亲和纯化柱进行蛋白纯化获得高纯度的融合蛋白，再利用GST亲和纯化柱进行蛋白间的相互作用检测。

PBS及PBS+1%Triton-100

PBS （1L）

NaCl：         8g

KCl：          0.2g

Na2HPO4：     1.44g

KH2PO4：      0.24g

加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌,4℃保存备用。

PMSF（苯甲基磺酰氟） MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可。保持于-20℃或者4℃。

（以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用）

1、原核融合蛋白A的获得

（1）将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21（DE3）菌株

（2）挑取单个克隆到含有5mlLB（+100ug/mlAmp）的10ml试管里，37℃培养过夜

（3）将培养菌液转移到含有500ml LB（+100ug/mlAmp）的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间（诱导条件需要根据不同的蛋白做调整），6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N

（4）室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混匀

（5）冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。至裂解液充分清凉

（6）11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清， -80℃保存备用

2、真核融合蛋白B的获得：将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白（如HA,或者myc）的真核表达载体上，进行细胞转染。

3、48小时后，取适量融合蛋白GST-A冰上冻融

4、取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜旋转结合1小时。

5、PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（ PBS+Beads）作Offer。

6、同时，裂解真核融合蛋白B，去尽培养基，用PBS（RT）洗一次，加入300ul裂解液（以6well为例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分钟。

7、吹打收集至1.5mlEP管，超声破碎。13000rpm，15分钟，4℃离心取上清。

8、BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其余样品加入到已纯化蛋白的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合！4℃旋转结合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。

9、40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心，Run –SDS PAGE做Western Blot检测。用HA或者myc Blot。

（1）高纯度的GST融合蛋白能够减少实验的假阳性。由于高纯度的融合蛋白能减少实验结果的假阳性，因此获得高纯度的融合蛋白对于GST-pull down 实验结果 分析具有重要的作用。同时，为了能够最大程度的保证融合蛋白原有的生物学活性，一般在获取融合蛋白时倾向于可溶性融合蛋白，因此获得高纯度的可溶性蛋白很关键。 对于可溶性蛋白的获得条件主要有①载体的选择。②可溶性蛋白表达条件的选择，③诱导温度，④诱导时间，⑤诱导物的浓度，能够不被细胞代谢而且具有稳定的浓度。

（2）GST标签虽然不会对下游蛋白的折叠和功能造成影响，促进重组蛋白的可溶性表达，但是GST标签可能会影响蛋白的正确折叠，因此对融合蛋白进行质量控制，会使实验结果更加可靠。

（3）在实验中，有时会加入核酸酶来消除可能桥接到蛋白上的DNA和RNA，也有可能会导致蛋白间的相互作用。

2. GST-pull down技术主要在体外验证两种蛋白之间是否有相互作用，其用途主要有两个方面：一是证明两种已知蛋白质之间可能存在的相互作用，二是用于寻找能与已知蛋白质发生相互作用的未知蛋白。